奧林巴斯顯微鏡激光共聚焦的應用

激光共聚焦顯微鏡的廣泛應用，包括在神經解剖學和神經生理學的各種各樣的研究，以及廣泛的細胞和組織形態學研究。 此外，越來越多地使用新的熒光蛋白的數量正在迅速擴大的耦合這些有用的工具，以現代微觀調查研究報告原文。 其他應用包括共振能量轉移技術，干細胞研究，漂白研究，壽命成像，多光子顯微鏡，全內反射，DNA雜交，膜和離子探針，生物發光蛋白，抗原表位標記。 下列各節中描述的許多這些**的技術。

在共聚焦顯微鏡的熒光基團的共定位 -乘法熒光標記標本的檢查和數字記錄期間，兩個或兩個以上的發射信號往往可以重疊在*終圖像中，由于其靠近內的微觀結構。 這種效應被稱為共存 ，通常發生在熒光標記分子結合到目標在于非常接近或相同的空間位置。 具有高度特異性的現代化合成熒光和古典免疫技術的應用已顯著提高，加上精密光學部分和數字圖像處理共聚焦和多光子顯微鏡所提供的馬力，能夠檢測生物樣品中的共存。

熒光探針 -在一般情況下，熒光探針的分類和應用分類根據它們的激發和發射特性，以及它們的化學和生物特性。 本節中的例子在每一個重要的生物類，包括核酸，多糖，脂質，細胞膜，細胞質，離子濃度，特定的細胞器中的探針的制表。 免疫試劑熒光蛋白探針在熒光顯微鏡具有根本的重要性。

熒光燈和發光蛋白 -在過去的幾年中，在調查的基礎細胞生物學與綠色熒光蛋白（GFP）和它的許多遺傳變異的研究已成為一個主要的主食。 另外，熒光素酶和水母發光蛋白的生物發光蛋白為研究細胞內的離子濃度的波動，和腺苷三磷酸（ATP）的檢測，是有用的。 現在市售的這些發光和熒光蛋白的光譜變種，打開多個標簽在活細胞實驗的可能性。

綠色熒光蛋白（GFP） -綠色熒光蛋白（GFP）及其光譜變體（黃色，YFP），青色（CFP），藍色（BFP），紅色（dsRFP））是在迅速成為重要的研究工具各學科與生命科學領域，包括醫學和生物學。 互聯網的快速搜索*近的文獻揭示每個月幾十個或多個報告。 綠色熒光蛋白*初是從水母中分離是一個專門的蛋白質，當暴露于激發光，發出熒光。 其主要用于當前研究的重要性在于在純化水母GFP基因在其它生物體中表達熒光蛋白的能力。 當一種非特異性的熒光蛋白質（或其變體的嵌合體）的基因導入的組織培養線，整個細胞質發出綠色熒光。

過去幾年中，具有幾乎跨越了整個可見光光譜的熒光光譜熒光蛋白調色板 -已經開發了一系列廣泛的熒光蛋白遺傳變異。 誘變廣泛的努力，在原來的水母蛋白導致新的熒光探針，該范圍內的顏色由藍色變為黃色，有一些體內報告分子在生物學研究中*廣泛使用的。 更長波長的熒光蛋白，散發橙色和紅色光譜區域，已制定了從海洋海葵Discosoma芨屬于類珊瑚蟲和珊瑚。 還有其他物種已被開采產生類似的蛋白質，有青色，綠色，黃色，橙色，紅色，和遠紅光的熒光發射。 發展的研究工作是不斷提升的亮度和穩定的熒光蛋白，從而提高他們的整體實用性。

光學熒光筆熒光蛋白質 -蛋白質分子可以激活從靜止狀態啟動熒光（這個過程被稱為光活化 ），或能夠被光轉換熒光發射帶寬從一個到另一個（ 光電轉換 ），代表可能是*有前途的在體內蛋白質的壽命，運輸和周轉率的調查方法。 適當稱為分子或光熒光筆 ，一般很少或根本沒有顯示的光活化熒光蛋白成像波長的激發下初始熒光，但顯著提高其熒光強度照射激活后，在不同的波長（通常較低）。 光轉化光學熒光筆，另一方面，經過時光學變化的生色團的熒光發射帶寬配置的變化。 這些影響導致的直接和受控的高亮顯示的不同的分子在細胞內池。

胚胎干細胞 -胚胎干細胞系，這是*初從人類囊胚的內芯，以及其他哺乳動物，現在研究界廣泛成立于使用傳統的體外培養。 細胞株傳代過程中保持其未分化狀態和正常核，但是，他們仍然能夠分化成幾乎任何類型的組織。 *增殖的胚胎干細胞成為干細胞（如神經元干細胞，肌肉干細胞，血管內皮細胞的干細胞，造血干細胞），根據在特定的培養條件下，然后分化成神經細胞，肌肉細胞，血管內皮細胞和血細胞。 然而，不像受精卵，胚胎干細胞的群集不能獨立發展成一個人（或其它動物）。

抗原表位標記的 -抗原表位（也稱為抗原決定簇的 ）是一種生物結構或序列，如一個蛋白質或碳水化合物，這是作為抗原的抗體，該抗體識別的。 識別的抗原發生適當的結構時，形成的區域中的蛋白質或氨基酸或糖多糖，其中的直線排列。 大多數蛋白質通常有幾種表位。 的抗體提供了一個重要的技術（稱為免疫測定法 ），用于識別特定的細胞成分（蛋白質，脂類，碳水化合物等）來跟蹤感興趣的活的細胞和固定細胞內的蛋白質的功能，分發和修改。

熒光壽命成像顯微術（FLIM） -多色用熒光染料染色觀察生物材料（如蛋白質，脂質，核酸，和離子）的分布的組織和細胞的研究領域中積極使用。 熒光觀察的檢測技術已經發展到一個單一的熒光染料分子的水平下*好的情況下，可以檢測到。 本節回顧熒光壽命成像顯微鏡（FLIM），一個新的熒光顯微鏡技術的幾個重要方面。 此外多色染色，還可以利用熒光壽命成像可視化的因素的影響，也就是說，在分子周圍的環境的狀態的染料分子的熒光壽命特性。

熒光光漂白調查 -這兩種熒光漂白損失（ 翻轉 ）和相關方法漂白后恢復（FRAP）技術通過漂白的熒光觀察細胞內的材料的運動。 甲一個浮動的細胞膜上的熒光染料，一種細胞器（內質網和高爾基體）膜，或一個浮動的熒光標記蛋白，這些膜的特定區域的漂白，和被觀察到的檢查流動性的損失或恢復熒光的橫向方向。 FLIP和FRAP的技術也可用來確認膜的連續性。

熒光共振能量轉移（FRET） -活細胞中特定的分子物種之間的相互作用的確切位置和性質，是許多生物研究領域的重大利益，但調查往往阻礙了研究這些儀器的分辨率有限現象。 傳統的寬視場熒光顯微鏡觀察熒光標記的分子內定義的瑞利判據，約200納米（0.2微米）的光空間分辨率的限制使本地化。 但是，為了理解在典型的生物分子的過程中涉及的蛋白質貿易伙伴之間的物理相互作用，分子的相對接近必須比衍射極限的傳統光學成像方法允許更精確地確定。 時，應用光學顯微鏡， 熒光共振能量轉移 （更通常被稱為用首字母縮略詞FRET）的技術允許測定兩個分子之間的方法，在幾納米范圍內的距離足夠接近，分子間的相互作用發生。

多光子顯微鏡 -多光子熒光顯微鏡是一種強有力的研究工具，它結合了*的光學技術，長波長多光子激發激光掃描顯微鏡捕捉到高分辨率三維圖像高度特異性熒光標記標本。 該技術具有三維分辨熒光成像的共聚焦顯微鏡成像活細胞和組織有吸引力的優勢。 多光子激發只發生在顯微鏡的焦點，*大限度地減少漂白和光損傷，活細胞成像的*終限制因素。 這一優勢使厚的活組織標本，否則不會有可能與傳統的成像技術的調查。

全內反射熒光顯微鏡 -全內反射熒光顯微鏡（TIRFM）是一個優雅的光學技術，用來觀察單分子熒光表面和界面。 該技術通常采用調查分子相互作用的表面，這是根本的重要性在細胞和分子生物學學科廣泛的面積。 全內反射螢光顯微鏡的基本概念是簡單的，只需要一個激發光束通過固體的玻璃蓋玻片或塑料組織培養容器，其中細胞粘附旅客在一個較高的入射角。 玻璃相和水相之間的折射率差調節光線如何被折射或反射的界面處作為入射角的函數。 在一個特定的臨界角的光被完全反射的光束從玻璃/水界面，而不是通過折射，根據斯涅耳定律。 在水性介質中，具有相同的頻率的入射光的反射產生一個非常薄的電磁場（通常小于200納米）。

纖維的FISH（ 熒光原位雜交） -長期纖維的FISH指的普遍做法延長染色質纖維制劑（FISH）進行熒光原位 。 映射還通過進行FISH調查，在染色體上的DNA片段，在幾百萬個堿基對的距離之內的信號彼此由于多方面的結構在中期染色體的DNA鏈是無法區分的。 染色體信號的分辨率提高了，如果之前使用它們進步充分冷凝。 我們可以做些什么，當我們要映射多個相鄰的DNA克隆嗎？ 創建地圖規模的一個堿基對整個基因組DNA序列的特性，將解決這個問題，但是是非常耗時的。

cameleons：鈣離子的探針 - Cameleons是一類新的活細胞內鈣離子濃度的指標，通過構象變化，在鈣離子存在下的熒光共振能量轉移（FRET）的結果。 在過去，熒光探針，例如，印度的Fura-2和Fluo-3用于測量活細胞內的鈣離子濃度的波動是非常普遍的。 在1997年，宮脅淳光，日本理化學研究所腦科學研究所博士開發了一種新型的鈣離子探針測量。 探頭由人工修改綠色熒光蛋白（GFP）的蛋白質，并命名為卡默萊昂 （變色龍爬行動物后，，但去掉名稱中的“H”）。兩個熒光蛋白（具有不同的激發和發射特性），鈣調蛋白（CAM），肌球蛋白輕鏈激酶（M13）和鈣調蛋白結合域之間的融合產品是仿照的卡默萊昂分子結構。 鈣調素結合的與游離的鈣離子和M13鏈后，它已綁定的鈣離子與鈣調蛋白結合的能力。 直線接合的這四種蛋白質的基因，該融合基因的表達在各種細胞中。

試樣制備合成熒光基團和間接免疫熒光 -激光共聚焦顯微鏡變得不僅僅是一個新奇在20世紀80年代初，由于廣角熒光的應用研究細胞的結構和功能上去。 由于免疫熒光技術，以及廣泛使用合成熒光染色的細胞結構，成為20世紀70年代中后期實行，顯微鏡變得越來越沮喪，他們無法區分或記錄精細的細節廣角儀器由于干擾發生的上方和下方的熒光焦平面。 今天，激光共聚焦顯微鏡，結合新的*的合成熒光，熒光蛋白和免疫試劑的應用時，可以探測亞細胞結構的**的方法之一。 本節中的地址中所述的協議的試樣的制備方法合成的熒光團耦合免疫熒光法是必要的，以固定的貼壁細胞和組織的冷凍切片，使用寬視場和激光共聚焦熒光顯微鏡調查。

熒光蛋白文學來源 -大大擴展能力，可視化，在光學顯微鏡下的高時空分辨率的分子事件，熒光蛋白的代表也許是*重要的探頭曾經開發細胞和植物生物學調查。 隨著互聯網的出現，為國際信息傳播的一種實用的車輛，大部分的科學出版物已開始使他們的內容上線書的摘要形式，HTML文件和下載的便攜文檔格式（PDF）文件，可以本地進行查看和打印。 在下面的章節包含列出的參考文獻索引服務的鏈接，以研究者提供了一個快速的途徑針對熒光蛋白的原創文學。