徠卡顯微鏡：多波長在熒光顯微鏡落射照明

熒光是一個過程，其中已吸收的光（光子）后的物質emitts的輻射的波長（顏色），其中長于吸收光，這個排放停止后立即停止激發。這種現象是熒光顯微鏡及其應用的基本元素。

除此之外，“古典”在光學顯微鏡下的熒光激發，有可能兩個或多個光子具有較長wavengths比發射的激發激光共聚焦掃描顯微鏡通過現代技術來獲得相同的發光效果。

 熒光作為autofluorescenc的生物和/或無機結構或所謂的次級熒光的特殊染料（熒光染料，熒光標記物）的處理后的檢體發生。要執行熒光顯微鏡，必須滿足以下要求：**的能量源（高壓汞弧燈，鹵燈等），選擇的激發光發出的輻射**的足夠的透射濾光器的系統（filterblocks）的，，*后但并非*不重要的是，適用于熒光，即集電極鏡頭，照明，分光鏡，目標，管鏡頭和目鏡光學零件和服裝。

與今天的情況相比，在*次施加透射光場和暗場顯微鏡的使用熒光顯微鏡。這是由于其有限的護林員在那些日子里的應用。但隨著組織學，細胞學，分子生物學和免疫診斷其重要性日益增加的需求，從根本上改善照明和觀測技術來越來越多。這是入射光熒光顯微鏡誕生的時刻。

在其近40年的應用和發展的過程中，這種技術成為常規和科研工作，在生物學，醫學，科學和工業的基本工具之一。入射光熒光顯微鏡的進步，尤其是由研究工作Ploem的他的功能引領趨勢也正向萊茨RESP戰略決定。韋茨拉爾徠卡光學儀器發展需要。

這個發展過程中是按時間順序描述在目前的貢獻。à提要熒光顯微鏡技術使顯微鏡，目標，熒光染料，光源和過濾系統有關的應用領域，并指這方法的相關信息。

圖 1a的：熒光多wavelenghts的落射照明器與四個二色光束分離器安裝在一個滑塊上，用紫外線入射照明，紫色，藍色和綠色的激發光的。建在阿姆斯特丹大學（Ploem，1965）。

圖 1b中：萊茨原型（沒有商業化的）與4個二向色分束器安裝在一個滑塊（Ploem，1967）的多波長的落射照明。

圖 1C：萊茨落射照明器與四個可交換濾光塊（塊）（卡夫，1972）。

不久與窄帶藍色和綠色的光激發它變得清晰，廣泛應用于免疫熒光異硫氰酸酯（FITC）和異硫氰酸四甲（TRITC）標簽檢測開辟了*佳的可能性。使用的藍色和綠色的激發也*小化的自體熒光的組織成分，與傳統的透射照明用UV光遇到不期望的效果。FITC現在可以興奮與窄帶藍色光（使用濾除帶外干擾的半寬度為16nm），在490 nm處（長波長藍色）的*大激發，清楚地觀察到綠色熒光發射峰在520納米。*小化組織成分的自體熒光（圖2a和b），在一個高的圖像對比度。激發FITC接近其*大激發啟用，即使是高壓汞弧燈，有沒有強烈的排放峰值在藍色波長范圍內，可以用這樣一個高效的激勵。此外，落射照明用的*次啟動，激發富爾根副薔薇苯胺的強汞（圖3a和b）在546 nm處的發射譜線的綠色反射分色鏡。

圖 2A：照亮寬波段紫外線激發與immunolabel（FITC）標記的組織細胞。注意藍色自發熒光的組織結構。

圖 2B：相同的組織和相同的免疫染色FITC標記落射照明使用窄帶藍色（490 nm）的光照亮。請注意，增加圖像的對比度（Ploem，1967）。

圖 3A：肝組織。細胞核染色進行DNA Feulgen反應pararosanilin的，可視化與傳輸綠燈。這污點被稱為吸收污漬，不知道是熒光。在晶核上亮起，導致事件窄帶綠光（546 nm）的紅色熒光。

圖 3B：肝組織。核Feulgen反應副玫瑰苯胺染色的DNA。落射照明與窄帶綠光（546納米）和二色分光鏡反射綠燈。大概顯微鏡用綠光激發（Ploem，1965）的*個例子。注意：大的圖像對比度。

在他的第二次出版的多波長落射照明器，描述一個的萊茨原型與四分色光束spittters（圖1b），Ploem 承認布倫伯格和Krylova的貢獻[ 2 ]。俄羅斯在這一段時間的研究，沒有任何主要的工業發展在俄羅斯或東德落射熒光顯微鏡的交通不便是萊茨沒有意識到這樣的發展早的原因。引進外延照明，紫外線，雖然有用的幾個應用程序，沒有被萊茨一個新的技術發展的動機，因為他們已經出色的傳輸暗場紫外光激發的可能性。增加世界廣泛使用的常規熒光顯微鏡在醫療診斷和分子生物學研究，然而，利潤落射照明使用窄帶激發新的可能性，用藍色和綠色的光。由于可以使用標準的高壓汞弧燈，這似乎是一個實際的建議。

隨后，徠茲分別紫外線，紫色，藍色和綠色的光[ 13 ] 開發了一種新穎多波長熒光epiilluminator的四個旋轉分色分光鏡（徠茲PLOEMOPAK） 。萊茨照明（包含四個分色分光鏡）屏障過濾器和旋轉炮塔激發濾光片在連續幾代增加了。*后一個優雅的落射照明，構建了卡夫[ 15 ]含有多組的激發濾光器，二向色分束器和一個阻擋或發射濾波器的組合，一起安裝在過濾器中的多維數據集，也稱為過濾器塊（圖4）。由于此照明燈迅速變成光路允許過濾立方體，多波長照明同款組織成為一個實用的命題。此外，四個過濾器的照明器中的多維數據集可被交換由用戶（圖1c）。兩套不同的四個濾光塊進行組裝，選擇從許多濾光塊，包含組合的激發，阻隔過濾和分色分束器，為不同的應用程序開發。經過建議Ploem，利時也產生了一個倒置的顯微鏡落射照明（圖5a和b）。多波長熒光顯微鏡的的萊茨PLOEMOPAK照明的審查，被稱為讀者評論普盧塔

左：圖。4：完成萊茨（徠卡）過濾器的立方體（塊）含有熒光顯微鏡：激發濾光片，分色分束器和發射濾波器（壘）。

圖 5A：徠卡倒置熒光顯微鏡，多波長落射照明。

圖 5B：寺崎^?塑料托盤與人類淋巴細胞移植研究后熒光細胞毒性試驗。倒置顯微鏡落射照明。

徠茲（徠卡）濾波器立方體系統是如此的高效，現在，39年后，相似類型的過濾器立方體仍然使用多波長熒光顯微鏡*顯微鏡制造商。這種發展*終導致在徠卡的發展，自動化的多波長熒光落射照明器，可容納8個濾光塊不同的波長范圍（圖5c）。當過濾立方體，電腦顯示器上的像素移位避免或保持在低于35 mm膠片由于0像素移位技術的分辨能力之間切換。此照明燈是現在使用的熒光原位雜交方法（FISH）染色體的研究。

Ploem [ 24，25，26，27，28 ]，范德Ploeg Ploem的[ 20 ]和奈恩和Ploem [ 18 ]進一步探索過濾器的組合，許多醫學領域的應用也得到了發展。這樣做是與肖特和Leitz合作。Rygaard和奧爾森等人[ 35 ]開發了一種新型的短波通高傳輸干擾濾波器具有非常高的傳輸和尖銳切斷對波長大于490納米的藍色光。

Ploem [ 23 ]結合SP濾波器與1毫米GG 455過濾器，阻止紫外線激發，肖特和建議的綠色光激發和激發一個過濾器Balzers公司開發的類似的過濾器（SP 560 = KP 560）紫光（LP 425 = KP 425）。后者過濾器適用于神經遞質[ 25 ] 調查。在圖6a和b中得到的藍色熒光可以觀察到。

圖 5C：徠茲（徠卡）機動落射照明器與八個濾光塊（塊）。

圖 6a的藍色熒光腎上腺素（加利福尼亞州）的神經叢和黃色熒光肥大細胞（5-HT）所包圍的小血管的大鼠腸系膜。甲醛誘導的神經遞質的CA和5-HT的熒光基團的熒光。

圖 6B：相同的組織和染色圖。6A：EPI-窄帶紫色激發光照明（LP 3毫米GG 400和SP（KP）425干擾過濾器），分色分束器495納米，反映了紫光和屏障過濾器LP 460納米。該過濾器立方體permittted的*次觀察藍色熒光腎上腺素能神經纖維，明顯不同的從黃色熒光肥大細胞（Ploem，1971）

從眼鏡行業方面，早對這些發展中的貢獻和評論寫卡夫[ 14 ]，沃爾特·[ 39，40 ]，特拉普[ 38 ]和赫爾佐格[ 8 ]。

落射熒光顯微鏡中使用的過濾器中定義的主類（一）主要激發濾光片LP（長傳）和SP（短傳） -德國文學被稱為KP過濾-及（b）二級過濾器作為屏障過濾器和發射濾波器等[ 23 ]。后者也被稱為熒光選擇過濾器，例如用于限制FITC熒光峰值在520 nm處觀察到這些。熒光顯微鏡的過濾器已被賦予由賴希曼[ 33 ] *近的一項廣泛的審查。

Cormane [ 3 ]首次證明，窄帶藍色光落射熒光標記FITC免疫人體皮膚疾病的研究中得到*佳的對比度。透射光激發紫外線燈，用來引起如此強烈的自體熒光在皮膚的彈性纖維，使可視化熒光抗體嚴重阻礙。

在七十年代的開創性工作萊茨落射熒光顯微鏡恰逢一個世界性的增加免疫和其他分子生物學方法，像魚在醫學診斷和研究中的應用。hijmans等。[ 9，10 ]首次證明萊茨新的多波長激發落射照明的實用性，對于某些類別的免疫球蛋白細胞的選擇性檢測，使用綠色熒光FITC和紅色熒光TRITC抗體共軛。他們應用的兩個波長的激發方法，使用藍色和綠色的光的選擇由一個發射濾光器在520nm處（圖7）的FITC熒光峰值。brandtzaeg [ 1 ]和Klein等。[ 12 ]有類似的發現，識別免疫重要的細胞類型，使用雙波長激發萊茨epiilluminator的。在染色血“玫瑰花結”的形成，使用UV和綠色的光的兩個波長的激發方法，可以顯示紅細胞周圍的單核細胞（圖8）

圖 7：骨髓細胞的抗-κB的TRITC共軛的抗-IgG FITC共軛染色。的EPI-illmination窄帶綠色和藍色光，導致TRITC和綠色熒光的細胞含有FITC標記的細胞中含有的紅色熒光。一些細胞中含有FITC和TRITC。

圖 8：人體血液細胞，“花環”的形成。藍色熒光染色芪使用外延照明用紫外光紅細胞染色。淋巴細胞激發后的綠色光（1965）與橙紅色的染色曙紅染色。