尼康顯微鏡：活細胞顯微漂移校正焦點

直到20世紀80年代末，大多數生命科學的研究生物的結構復雜的細節，捕捉各種使用固定和染色標本（實際上，非生物）的細胞學特征的單一快照。然而，在過去的幾十年中，在生物科學和醫學的研究已經在很大程度上轉移了重點調查浩大的時間尺度上，從幾毫秒到幾小時不等的生命系統的分子，細胞和整個生物體水平上發生的動態過程。過渡到活細胞成像的司機已經*的顯微儀器和更敏感的數碼相機的發展，以及新的合成和基因編碼的熒光基團，能夠針對特定的細胞器，具有精度高。因此，已經在很大程度上取得了單桿固定，死細胞的顯微照片和數字圖像時代的活細胞成像，使用廣泛的合成探針，量子點熒光蛋白，維持細胞在顯微鏡舞臺上的焦點長時間是一個關鍵任務的因素。

時間推移活細胞成像技術在透射光熒光顯微鏡的應用越來越也許是*好的證明了數量浩繁的研究報告，幾乎每天在科學文獻中出現。在大多數情況下，細胞活性監測在組織培養中的成像腔室專門設計的顯微鏡載物臺，使用熒光探針耦合到順序的圖像捕獲技術。可以采用廣泛的在長的時間期間內的標本作為連續序列的用于記錄的動態對比增強的高級技術，如微分干涉相差（DIC），相襯，暗場，熒光，和Hoffman調制反差（HMC）。同樣，更*的熒光技術，包括激光掃描共聚焦，旋轉盤，多光子，和全內反射顯微鏡（TIRF）越來越多地被用來監測細胞內過程，隨著時間的推移。

除了 其在細胞生物學中的重要性，時間推移成像也可以用來研究廣泛的液體樣品和固體材料在化學，工業，和地質系統，以及液晶的相變和結構分析的新的和*金相材料。時間推移成像（也稱為cinemicrography）在基本的生命科學領域，已被證明是一種有效的工具，調查粒子的運動，分子間的相互作用，細胞遷移，細胞分裂，細胞器動力學，細胞凋亡，分化，神經過程的產物，而其中新的和有前途的應用程序的主機。*近，發展跨越整個可見光譜的熒光蛋白的**已經導致發現無數的動態細胞內事件隨著時間的推移，只能通過觀察調查。

圖1給出的是從一些更加有用和流行的時間推移成像對比增強技術，在活細胞顯微鏡的例子。粘附印度麂鹿皮膚成纖維細胞在圖1（a）所示，在DIC模式成像，可視化應力纖維細胞骨架的產物。相襯成像袋鼠大鼠腎上皮細胞（PtK1線）圖1（b）中揭示了一個雙核細胞產生的中止細胞分裂，而個別人成骨肉瘤（U2OS線）細胞被捕獲成功的分工與HMC圖1（c）。這些功能**的透射光技術被廣泛利用時間推移活細胞成像。同樣，激光掃描熒光技術和旋轉盤共聚焦顯微鏡（圖1（d）中DEOS熒光蛋白在中國倉鼠卵巢細胞中，和圖1（e）中，EGFP-標記在HeLa細胞的內質網）可以采用數的觀測，包括光活化，共振能量轉移（FRET），光漂白技術，運動性，熒光蛋白分布的動態。全內反射熒光顯微鏡（全內反射螢光顯微鏡，圖2（f），示出mCherry融合到紐蛋白狐肺成纖維細胞中的熒光蛋白）的事件發生在細胞膜附近的蓋玻片。

時間推移成像的歷史透視

報道時間推移成像在活細胞中的首次應用在100多年前（大約五年之前，查理·卓別林他的*部電影），由一位年輕的法國研究生在梅毒螺旋體檢查蠕動。學生，讓Comandon耦合到一個更小的暗視野顯微鏡，一個復雜的配置期間使用一個巨大的電影膠片相機拍攝的圖像序列，但認為很簡陋，按現代標準。在二十世紀后半期，通常采用緊湊型16毫米相機配備相襯照明顯微鏡時間推移圖像序列的。由笨重的輔助intervalometers的，，可將燈泡的裝置，打開和關閉，以避免過度的照明和加熱的標本的圖像之間的連續的圖像捕獲之間的時間間隔的控制。光源電子顯微鏡百葉窗市售直到20世紀80年代。

早期時間推移依靠膠片相機的成像技術受到一些陷阱。*重要的是，這部電影被發送出去（在大多數情況下），商業處理，這意味著可能會延遲幾天甚至幾周，實驗結果的評價。此外，膜的使用是昂貴的，并可能會到一個主機的處理變化，通常導致不一致的結果。例如，暴露的錯誤可能不會被發現，直到幾個星期后，實驗已得出結論，焦點漂移的常見的問題往往是不可檢測的，直到處理過的膜被看過。雖然很多時間推移成像，如焦點漂移，試樣加熱不均勻和振動相關的文物，仍然妨礙用現代數碼相機的*終結果時，該技術已在過去十年顯著成熟。

視頻管攝像機和圖像采集卡的電腦卡時發生的*次重大進步時間推移cinemicrography中終于整合與顯微鏡，在20世紀70年代開始。雖然由視頻攝像機產生的圖像是較低的分辨率比傳統的基于乳液的膜，與膠片相機的曝光設置的不確定性顯著降低。作為一個額外的好處，對圖像序列可以被視為在收購過程中，和一個較長的時間推移實驗的結果是立即可用的審查和編輯使用的錄像帶輸出。相比較而言，耦合到一個錄音機攝像機的成本顯著小于膠片處理的費用被認為是一個電影時的電影攝影機。相對于膜的錄像帶的復制成本也少得多，磁帶含有不良序列可以被擦除或覆蓋放回生產。

活細胞動力學的一個例子是圖2中使用photoconvertible 光學熒光筆熒光蛋白標記的線粒體。標本是一個堅持的兔腎上皮細胞培養（RK-13 線）紅-的綠色photoconvertable DEOS到線粒體靶向肽序列的熒光蛋白融合表達。用488納米的激光照射后，豐富的線粒體，整個細胞質中觀察到（圖2（a））的綠色熒光。一個單一的線粒體位于長filopodium在是使用一個簡短的脈沖光轉換，從405納米激光在*幀。新紅色熒光的細胞器被捕獲后，未轉換的線粒體途徑（圖2（b））的時間間隔為20分鐘。粉碎后，使未轉化的線粒體密切的光轉換鄰居（圖2（c）），兩個線粒體其后的保險絲（圖圖2（d））的光轉換的熒光蛋白標記細胞器之間的分布的方法。的第二碎片事件后（圖2條（e）），一小部分的光轉換線粒體接近的第二未轉化的線粒體，但，而不是定影，形成一個環形（圖2（f））。在圖2所示的幀選擇從時間推移序列含有*過1000個在2小時內收集的圖像。

雖然越來越多的研究者開始參與時間推移活細胞利用熒光蛋白質序列采集，數字靜止圖像記錄長時間在細胞培養的動態事件繼續被廣泛采用。在許多情況下，間歇性的單一的圖像可以被捕獲，具有改進的信號與噪聲的使用更大的照度水平比是可行的串行時間推移成像在更高的分辨率。然而，技術的迅速發展，計算機體系結構和數據存儲能力，推動時間推移cinemicrography到一個新的水平。上一頁主存儲器中的局限性，已克服了快速緩存，處理器速度和硬盤驅動器的能力，使復雜的含有數千幀的圖像序列，組成幾個GB，可以存儲在本地的主機計算機上。硬件的進步已經由新的和復雜的軟件套件能夠控制幾乎所有方面，包括高速圖像采集階段，運動，光照強度，曝光時間（和其他的相機參數），輔助的光學元件（如DIC棱鏡平行光路）和波長。**的軟件也可以進行收購后的圖像處理，增強的視頻功能。在簡單的系統中，中等性能的計算機可通過一些接口來控制科學級數碼相機。

現代的專門的熒光顯微技術，包括激光掃描共聚焦，旋轉盤，全內反射熒光，和多光子耦合到新興電子倍增電荷耦合器件（EMCCD）技術的進步，已使科學家能夠觀察到了廣泛的動態事件，利用新開發的熒光針對特定的細胞區室，生物分子和受體蛋白的探針。通過采用這種*的方法，多個事件可同時被記錄，可在四個或更多的尺寸（橫向，軸向，時間和光譜）在一個選定的時間內進入細胞內的活性，提供一種非侵入性的窗口。此外，活細胞成像技術已經導致了當前的**，這是科學家提供空間和時間的信息是以前無法在細胞生物學。

焦點漂移的起源

盡管各種各樣的技術進步，在過去幾年發生在光學顯微鏡，標本對焦緩慢變化的過程中，時間推移成像表現軸向波動仍然是一個重大的問題。焦點漂移的術語經常被用來描述的顯微鏡不能保持在一個延長的時間內選定的焦平面。此構件是獨立發生的自然運動的活標本，主要影響的因素，下面列出了一些。在一般情況下，重點漂移更是一個問題，當使用高倍率和數值孔徑的油浸目標（有一個非常淺的景深），比它低倍率（10倍和20倍）具有更廣泛的震源深度的目標。

• 熱漂移 -焦點漂移溫度變化也許是*常見的來源。作為一個結果，在實驗室中的空調和中央加熱單元，在顯微鏡上的強烈的照明光源，以及受熱不均目標和階段產生的溫度波動通常是主要的焦點漂移的罪魁禍首。此外，差的膨脹和收縮率的材料用于構造培養室和/或顯微鏡光學列車可能會導致物鏡前透鏡與蓋玻片之間的距離的變化，導致失焦。具有*高的倍率物鏡，只是一個度的變化往往足以產生在焦平面上的偏移在0.5和1.0微米之間。

• 蓋玻片的Flex -熱梯度和其他變化，在培養室的溫度，以及與迫使流體通過灌注過程中的攝像室的工件，可以制作試樣反彈的重點蓋玻片彎曲膜片效果。此神器往往是明顯的在灌注系統控制不佳室。蓋玻片彎曲可能不存在重大問題灌注會話之間可以是交錯的情況下，圖像采集序列，但它會嚴重影響這些研究需要相對較高的時間分辨率（2秒或更少）。蓋玻片的彎曲可以通過減少灌注輸入端口的直徑在流室，和裝備在顯微鏡用客觀的加熱器，補償室溫度波動*小化。蓋玻片小，但重現性好，運動也可能發生在文化室配備，透明導電涂層，以維持溫度。在這種情況下，施加電流負載的涂布蓋玻片可以產生收縮或擴展暫時打亂焦點。正確的焦平面通常會被重新建立，一旦電流負載被刪除。

• 成像室加熱不均勻性 -活細胞成像腔中產生各種各樣的配置，通常使用完全不同的技術，保持在恒定溫度下的試樣。例如，設有加熱用導電涂層的蓋玻片（圖3（a））的腔室通常在整個玻璃表面產生***的熱一致性比腔室，熱只蓋玻片的周邊周圍的金屬。在后一種情況可能是巨大的熱梯度（圖3（b））。此外，高數值孔徑的油或水的浸入目標可以作為一個接收器進行從試樣腔室并進入金屬目標的熱量帶走，這樣就產生了在該區域的液浸介質的熱梯度。其他文物，如電流從電源和室溫大幅波動變化也可以負責標本室加熱違規。



• 振動 - 與眾多的起源-一種常見的神器，振動往往會產生各種器樂配置相關的元素，除了在周圍環境產生的來源。在顯微鏡和配件，過濾器車輪，百葉窗，自動階段，過濾器的炮塔，和其他機電運動部件，是一種常見的振動源，干擾穩定的聚焦。常見的外部（非顯微鏡）振動源是空氣處理系統，客流量，冰箱壓縮機，電梯，重型設備附近的成像設置的議案。隔離表，減震墊，臺式平臺，從各種各樣的分銷商的使用，是有用的，以減少振動。

• 機械不穩定性 -滿載目標的物鏡轉換器3和5磅重，這往往代表了顯著的引力涉及顯微鏡對焦機構的機械部件上的應變。因此，重點漂移可能發生，只是由于物鏡轉換器上的引力。此神器可以只使用一個單一的目標，記錄的時間推移錄像，在一定程度上緩解。此外，它是明智的，以確保（如果可能），配備有具有短的機械長度的精密聚焦系統的顯微鏡，聚焦張力控制以維持適當的設置。機械不穩定性的其它來源包括松散的齒輪組，在焦點機架或冷凝器的支柱，以及輔助元件。

• 沉浸媒體波動 -在高分辨率活細胞調查的時間推移實驗，在顯微鏡目標可能需要浸泡介質油，水，甘油組成。需要收集到足夠的數據，粘度波動和化學分解的成像介質在長時間浸沒介質的屬性和傳播的影響。浸沒油的粘度和折射率也常常依賴于溫度和水容易蒸發，是必須考慮的因素和監視，以避免焦點漂移。新開發的高性能有機精油可在廣泛的折射率（包括水和甘油是相同的值），并提供*的解決方案，采用傳統浸泡媒體。在某些情況下（取決于成像室配置），墊圈或管道可以利用形成的目標和蓋玻片之間的密封，以減少水蒸發的水平。

• 添加試劑 -許多調查需要改變培養基或添加化學試劑時間推移成像序列的。引入到培養室中的試劑的實際行為，可以產生機械沖擊，這將導致在焦點漂移，加入試劑，不作為成像介質在相同溫度下，可以產生類似的效果。在加熱灌注系統中，引進的新的媒體或化學品產生的軸向聚焦平面的顯著的改變，但加入一個開放的腔室，使用移液管或注射器的液體，可以擾亂焦點。

• 側向階段呈 -在某些情況下，房間內的溫度波動或振動會產生一個小的橫向（ - Y）翻譯的機械載物臺，（在某些情況下）會導致軸向聚焦漂移。這通常是一個微不足道的問題，但可以成為嚴重的，如果一個開放的管道推動直接在顯微鏡上的冷或熱空氣。如果階段都配有一個夾子，它應該被啟動，開始時間推移成像之前，但除此之外，也有一些補救措施。*的顯微鏡階段，采用步進電機一般不影響由橫向移動文物。

• 不安全標本室 -試樣成像室運動在時間推移順序可能會導致焦點漂移由于蓋玻片到新的位置。適配器固定玻璃底培養皿舞臺光圈在第二階段，在盤位置的變化可能發生的結果柔性鉗或干擾電線和氣體/液體腔油管連接控制器和其他機械制品，如輔助元件。此外，經常遭受多井成像室時從輕微安置變化連接到單獨的蓋玻片每口井，導致聚焦誤差，同時掃描板。商會的運動和蓋玻片高度不一致是一種常見的定期神器，必須加以解決。

• 標本運動 -活細胞成像的一個不可避免的神器是遠離的標本在顯微鏡焦平面的運動。這通常發生在收集貼壁細胞進行有絲分裂，細胞顯著改變形狀，在中期時間推移序列。在其他情況下，試樣完全可以移動的視場，可以通過分離蓋玻片或通過蠕動。除了 使用凝膠和試劑，如纖連蛋白，錨定的細胞和組織的蓋玻片，有沒有機械，化學或電氣補救辦法試樣移動。

焦點漂移的解決方案

多年來，糾正焦點漂移的*佳解決方案是到車站學生或技術人員在顯微鏡附近，以提供手動重新聚焦在必要時。不幸的是，這是一個相對成本太高，基本上是無效的解決方案，那肯定是不適合長期的成像實驗。通過多種途徑，包括軟件算法，硬件專用的顯微鏡，防震襯墊和表，并包圍在一個保護環境（如在圖4中示出），在顯微鏡焦點漂移的問題已得到解決。在這些方法中，得到不同程度的成功，但都沒有提供一種通用的解決方案，可以擴展到幾乎任何活細胞成像場景的焦點漂移。

對熱不穩定，這也許是*重要的焦點漂移源，可以在很大程度上消除了大的有機玻璃外殼（被稱為環境試驗箱 ;圖4（C））絕緣顯微鏡，從外部環境，也提供了良好的條件，促進日志期的細胞生長。的保育箱式的外殼包圍，幾乎涵蓋整個顯微鏡和標本的顯微鏡載物臺，目標，熒光過濾器，和傳輸的光線的聚光。這些房間可以使用與多種文化的容器，包括標準培養瓶，培養皿，安裝蓋玻片顯微鏡載玻片和各種各樣的開放式和封閉式的成像室。與外部加熱單元（通常強制空氣）和二氧化碳的濃度來控制的感測單元，其耦合到一個穩壓器，它的輸入由純氣體的氣缸的溫度被保持。

環境室配有濕度控制等多種設計方案也可以提供橡膠手套訪問操縱細胞時，在成像過程中對環境的平衡，以避免干擾。為了維持高度的溫度控制，以避免焦點漂移，一些更復雜的孵化室括幾乎整個顯微鏡目鏡，攝像頭，lamphouses異常。在下行路上，環境試驗箱可以阻礙快速訪問標本和繁瑣的重復操作時是必要的。此外，腔室內部的高濕度水平可加至維持齒輪潤滑油過早降解和氧化的金屬表面和透鏡涂料由于儀器費用。作為替代方案，耦合階段的*佳孵化器的目標加熱器可以使用，但這些設備并不總是具有難以去除的保護桶浸入目標兼容。

在過去的幾十年中已經制訂了一些軟件算法，以解決基于對比度或邊緣檢測的焦點漂移。許多這些*終被納入科學的設計也處理圖像和控制顯微鏡的成像軟件包。軟件控制的焦點漂移需要在顯微鏡配備了一臺數碼相機和電動物鏡轉換器在計算機控制下。通常情況下，重點調查的基于軟件的顯微鏡需要兩個互補的算法來實現聚焦控制。首先建立一個客觀真實的焦點的軸向（z）的位置之間的對應關系。第二個是一個搜索算法（圖5），樣品的焦平面，所捕獲的圖像，以確定*大聚焦“分數”（*佳位置）的位置。然而，大多數軟件控制重點開發的算法，已建立使用靜態的標本具有穩定的幾何和動態活細胞時間推移調查時，適用于遠低于有效。此外，該算法通常是優化的一個特定的照明情況下（明場，相襯，等），可能會失敗時，適用于對比度增強技術（如熒光），它們并沒有設計。

軟件聚焦算法一般依賴于一個事實，即良好的聚焦圖像中含有較多的對比度或重點比圖像更精細的細節（實際上，更高的頻率）。作為一個例子，使用拉普拉斯算子來估計焦點時，該算法計算圖像樣本的二階空間導數，向上或向下移動的目標由一個預先確定的量，然后重復該過程，直到確定*適合。越來越小的步驟通常是在兩個方向上，在分析過程中。從過濾器的輸出值表示大的強度的變化，這通常表示一個圖像內的邊緣區域。在任何圖像，*高的頻率成分發生在邊緣，當試樣是優化的重點，應該是*突出的特點。為重點的漂移，邊緣模糊，在圖像上產生較低的二階導數。直到確定*合適的重復采樣。這通常需要幾分鐘的時間，只有那些時間推移實驗需要使用較長的時間間隔拍攝圖像之間的降級軟件重點例程。

在共聚焦時間推移顯微鏡，每一個形象仍然是大家關注的焦點，無論儀器是否遇到軸向漂移，對焦校正可以通過定期收集了一系列從標本z棧的（光學部分）的厚度，不論。各個堆進行分析，然后使用軟件來確定?堆棧中的每個圖像的參考圖像的記錄，可在該序列的開頭之間的Pearson相關系數。堆疊分析后，具有*大相關系數的圖像的像素強度是用來識別正確的焦平面（對應的參考圖像的平面）。共定位信息可以被用于重置的焦平面上的目標。雖然這種技術應該工作得非常好，提供的軟件和硬件正確連接，目前還沒有商業應用。

從理論上講，熒光標本應使用軟件算法產生極好的效果，由于之間有極高對比度的明亮的熒光結構和黑暗的背景。然而，在實踐中，基于軟件的補償技術需要基于捕獲圖像的幾種熒光物種，這可能會導致光漂白和光毒性加重每次曝光時與試樣光的效果的計算。此外，該算法確定重點用清脆的生產工具集中的軸向焦點位置（如共聚焦，多光子，DIC）光學部分，無論實際上是無用的。使用軟件時，保持焦點另一個缺陷是，該算法往往能決定一個*佳的，不同的是開始時選擇的時間推移序列從初始平面的焦平面。當使用組合的熒光與軟件確定聚焦算法，另一種方法是用試樣的透射光圖像進行聚焦分析步驟。然而，這需要應用機械快門的熒光和透射的光路中，可引入額外的振動。

圖6中所示的兩個時間推移進行沒有任何焦點漂移校正（圖6（a），圖6（b）和圖6（c）），或基于硬件的焦點維護系統的，如下面所討論的序列（圖6（2），6（e）和（f）條）。樣品是狐肺癌（FoLu線）成纖維細胞的培養，表達的mPlum熒光蛋白的融合產生的明亮的熒光的細胞器線粒體靶序列。圖像聚集在的組合熒光和DIC模式在30秒的時間間隔*過7小時內共聚焦顯微鏡操作。如果沒有自動對焦系統，在顯微鏡迅速失去焦點，證明熒光強度在圖6（b）和圖6（c），其中發生在不到45分鐘內連續虧損。相比之下，硬件自動對焦管理產生銳利，整個調查的良好聚焦圖像（圖6（四）通過圖6（f）條）。

焦點漂移補償系統

多年來，已開發了一些基于硬件的解決方案，以補償焦點漂移。在大多數情況下，這些設備試圖測量的目標和試樣夾持器或階段之間的距離，以保持試樣在很長一段時間的焦點。例如，渦電流傳感器連接到顯微鏡的物鏡轉換器的設計是由一個發明者監視的距離的階段，使用的直流電動機耦合到聚焦機構的正確的波動。另一種技術利用的試樣夾持器和領子連接的目標，以提供支撐的試樣夾持器的壓電元件的誤差信號之間的距離相關的電容。第三，更復雜的方法依賴，全息光柵放置在客觀瞳孔保持標本的焦點。專門的光柵產生兩個散焦的*，被檢測到的圖像由單獨的傳感器來產生聚焦校正信號。*后，納入到現代的硬件解決方案的前體使用兩個光電二極管陣列的離軸的氦 - 氖激光束被定向到一個小的棱鏡放置在光學列車和監測的背面反射的焦點依賴性變化。自******移的焦點被檢測為一個非零的差信號，然后將其用于驅動一個簡單的電機連接到細焦點的機制。雖然這些硬件焦點補償方案在不同程度上取得了成功，都沒有看到值班商業顯微鏡系統。

作為一個通用的方法來提高顯微鏡聚焦穩定性，制造商已經花費了相當大的努力來生成工程改進焦點漂移降低到*低限度。例如，一些嵌入式的機械系統（對焦組件，百葉窗，電動平臺，炮塔旋轉）的改善，重目標的問題得到解決。儀器幀正在制作專門合金的是耐熱膨脹的，而輔助元件如物鏡轉換器正在與耐熱聚合物。這種改進已經加上*的線性編碼器，機動階段或物鏡轉換器組件，可以搬遷到一個精確的位置精度優于50納米。即使這些改進導致了*的顯微鏡，可以保持注意力集中于一兩微米或更長的時間內，它們仍然無法克服的事實，加熱試樣室（以及它們的相關聯的蓋玻片）熱膨脹和收縮，導致備份到原來的焦點漂移問題。

為了解決熱漂移文物固有的幾乎所有基于蓋玻片成像室，顯微鏡和廠家售后*近推出新的硬件解決方案，以彌補焦點漂移雇用幾個有所不同，但仍密切相關的方法。一個重要的一點要注意的是，與浸沒目標，其中的大部分設備基礎上進行操作的假設下觀察試樣，并在蓋玻片的水性表面之間的關系是固定的（因此，細胞或薄的組織是不自由浮動在培養液中）。相反，無論是自然粘附在玻璃上的細胞或組織（例如果蠅卵室）或通過，層粘連蛋白，纖連蛋白，多聚賴氨酸，或糖蛋白的薄層連接到蓋玻片。所有的市售系統定位上的外部蓋玻片表面（玻璃及組織培養基或緩沖液之間的界面），通過測量弱的近紅外線激光或發光二極管（LED所發出的反射光的位置的形狀的線圖案;圖7中所示）。相反，對于干燥的目標，從蓋玻片的下表面（與空氣接觸）的光反射是用來確定試樣是否是關注的焦點。

插圖圖7圖焦點漂移補償系統如何能夠利用從蓋玻片衡量相對焦點位置的光的反射。試樣中感興趣的一個區域是用于由操作者設定的初始偏移量，其中規定的焦平面上，并作為補償（圖7（a））的基礎上蓋玻片表面。當焦點漂移時（在此，更接近客觀的蓋玻片的軸向運動，如圖7（b））的結果，檢測到的強度的激光或二極管反射從蓋玻片提供所需的信息來重新定位目標，并恢復偏移補償。因此，電動軸向對焦單元接收的反饋補償系統，以糾正檢測到的漂移在蓋玻片，然后恢復到預定義的軸向值偏移，提供銳聚焦的試樣（圖7（c）和圖7（d） ）。請注意，試樣本身是不參與聚焦校正，而上面的玻璃 - 水界面的反射控制這些設備所產生的干涉圖案。

的一個流行的，廉價的售后商業聚焦校正系統的操作，通過測量從蓋玻片使用全內反射的近紅外LED光源的反射率的。這種設計在操作時非常有效地使用高數值孔徑物鏡（1.4或更高）一起可被改進的聚焦控制電機，以*********微鏡幀。在使用全內反射以評估焦點的主要限制是*的要求非常高數值孔徑的油浸目標，以實現聚焦測量光束的入射角的臨界角。缺水和水浸泡的目標，具有更小的數值孔徑，物鏡的數值孔徑必須顯著高于試樣及其周圍介質中沐浴在生長的活細胞（約1.33至1.38的折射率這一事實，本變形例中，由于不適合或成像介質）。因此，雖然適合高分辨率活細胞成像調查的大多數，這個裝置是不是適用于水浸泡的情況下，或進行高通量的考試，涉及多孔板和干目標是至關重要的。另一個售后市場產品采用一個高分辨率的傳感器（5納米的精度）來衡量，以確定聚焦的物鏡前透鏡和被檢體之間的間距。在該裝置中，安裝在目標的目標線程和物鏡轉換器之間安裝一個壓電納米定位。的納米定位的運動范圍是大約100微米，這是足夠的，提供了廣闊的焦距范圍。

各大顯微鏡制造商在過去幾年已經******一些商業焦點漂移補償裝置。所有這些系統的目的是利用近紅外光反射從的蓋玻片媒體接口在活細胞成像室確定的目標之間的距離和蓋玻片，但沒有一個是適合使用高折射率的介質中固定的標本（接近1.5，的值大多數蓋玻片）。在操作過程中，通過專用的光學系統，其與主顯微鏡的光學列車相交源自激光或LED的線狀光，由物鏡聚焦上支持下觀察細胞的蓋玻片和介質之間的界面。從該界面的反射光，然后傳送到校正光學系統的焦點和一個專門的，集成的電荷耦合器件（CCD）的表面上。CCD所獲取的反射光的強度和位置的基礎上，該軟件的反饋系統建立的玻璃-水界面或物鏡焦點之間的關系。

激活后的焦點校正硬件，操作員可以引入一個偏移移動物鏡焦點的選擇區域內的檢體的界面處，同時保持相同的參考點，從而提供清晰的對焦的試樣，在一個特定的界面距離的（見圖7）。因此，偏移值被定義為物鏡的焦平面之間的距離和水玻璃（或玻璃-空氣）接口邊界。根據制造商，這些重點補償系統能夠監測和糾正焦點漂移在不同的時間尺度上，從幾毫秒到10秒或更長時間不等。這提供了一個明顯的優勢，在基于軟件的聚焦補償例程。此外，在大多數情況下，注重漂移補償參數可以被定義在坐標漂移校正圖像采集，以及將與其他外圍設備，如快門，濾光片輪，電動載物臺的顯微鏡控制軟件。

長期聚焦漂移硬件補償之前和之后的一個例子是圖8中的（一）。該標本是貼壁培養的人類腫瘤細胞（HeLa細胞線），與EGFP融合了人α -微管蛋白的標記。圖像被抓獲一個60X的油浸物鏡旋轉盤共聚焦顯微鏡的熒光照明下，在4分鐘的時間間隔四個小時。在飼養細胞在蓋玻片的溫度被保持在蓋玻片周圍的金屬的元素嵌入在一個電阻的加熱腔室。在顯微鏡實驗室溫度下降一攝氏度，每小時的速度。過一段時間240分鐘，沒有硬件補償，焦平面的軸向位移約2.8微米。相反，在硬件焦點漂移校正，焦平面的精確度約200納米，在相同的時間內保持。圖8（b）表示打開檢修門平衡至1分鐘，為期37攝氏度的環境室的影響。請注意突然浸在軸向位移（約3.4微米），溫度沖擊的結果發生。

國家的**的聚焦漂移補償硬件的一個例子是尼康**的對焦系統（PFS），這是融入軸向控制硬件的Ti-E系列倒置顯微鏡（如圖9所示）。廣泛的干式和油浸目標，從4倍到100倍，具有不同數值孔徑，可以采用的Ti-E-PFS儀器聚焦補償。于加油站的目標的工作距離范圍覆蓋120微米至*過15毫米，得到高度的通用性。近紅外線LED 870納米和加油站所使用的CCD行傳感器被安置在一個專門的物鏡轉換器單元（圖9），不需要無窮大的空間，使主顯微鏡的光學列車繼續致力于成像。其中**的功能的尼康PFS為5毫秒（200赫茲）的采樣率，這是獨立的顯微鏡和相機控制軟件，大大快于其他系統，必須反復探測蓋玻片接口到焦平面利益。利用長波長的LED，可以使用在340和750納米之間的波長范圍內發射的熒光團的Ti-E-PFS。此外，加油站可以使用種類繁多的對比增強成像模式，包括明場，相襯，霍夫曼調制相比之下，DIC，廣角熒光，激光共聚焦，TIRFM，旋轉盤，和線掃描后掠場。

上述的的聚焦漂移校正系統的設計主要是容納在專門的成像腔室蓋玻片的厚度范圍從150到180微米（＃1或＃1.5蓋玻片）配備圖像的活細胞。其他標本可能要困難得多觀察焦點漂移校正由于微弱的紅外線反射或過度的散射光。這些包括高折射率的介質（更緊密地匹配，在蓋玻片）被安裝在固定的標本。在這種情況下，從聚焦監控系統的反射光的量可能不足以檢測到的接口表面。同樣的，厚實的組織標本，分散了大量的光，是很難用焦點漂移校正。厚玻璃蓋玻片（大于180微米）或塑料組織培養皿不推薦，因為可能無法檢測的邊界表面由于沒有足夠的偏移。*后，蓋玻片上表面的灰塵和碎片可以降低邊界檢測精度，導致過度捕獵或焦點校正錯誤。

盡管目前可用的的焦點漂移校正系統的設計測量反射從蓋玻片接口，提供了眾多的選擇和潛在的缺陷的研究人員進行長期的時間推移成像的變化從一個設計到另一個。主要興趣是主要的商業系統之間的價格變化，從而使研究人員能夠在某些情況下，選擇一個解決方案，更緊密地與適合他們的預算比他們的實際活細胞成像需求。如上所討論的，一些廠家售后提供輔助聚焦校正單元可被改進用于在現有的機動（非機動項目）的顯微鏡。與此相反，更精致的顯微鏡制造商所提供的交鑰匙系統完全集成到其反相的幀，因此不需要修改的光端口，用于安裝在顯微鏡或使用。所有的焦點校正系統能夠成像的多個特征在不同的橫向和軸向位置（實際上，在每個時間點為每一個拍攝的視場）。

評估商業焦點漂移校正系統時的一個主要考慮因素是反饋回路的頻率監控和調整的重點。尼康PFS系統提供了一個持續活躍的機制，獨立的顯微鏡和相機控制軟件運行，而其他每個圖像被捕獲之前，立即進行重點檢測和校正過程。每種方法的優點和缺點。例如，如果實驗涉及實時圖像捕獲，然后的尼康PFS系統采用連續進料的作用機制可能是更有用的，因為它會漂移校正獨立軟件調用。然而，對于實驗中捕捉圖像在長時間內間歇性是重要的考慮因素，速度較慢的系統評估焦點之前，每個圖像捕捉可能是足夠的。在一般情況下，在選擇的聚焦補償系統的首要考慮的是圖像被捕獲時的速度。更快的系統執行以及在長的時間間隔拍攝圖像，而較慢的系統將是用處不大的圖像捕獲的時間間隔短于3?5秒。

在典型的時間推移的情況下，其中一個顯著的延遲之間發生圖像捕獲，需要短的時間間隔來測量反射率，然后偏移到一個特定的軸向位置蓋玻片以上是無關緊要的。然而，當收集流中的圖像的每秒30幀或更多的快速脈沖串時，*快的補償系統會顯示**的性能。然而，應當指出的是，根據設計，一個連續的反饋系統可能不能夠完成補償步驟，而系統仍然是狩獵的參考平面之間的每一個暴露在捕獲圖像的風險，因此可能會對。在這種情況下，產生的視頻經常遭受播放時的抖動工件（不可預知像素沿的橫向軸發生間歇每隔幾幀轉移）。連續捕獲驅動聚焦補償系統之間進行選擇應考慮的另一個變量是總的實驗時間。時間推移實驗的范圍可以從幾秒到幾個小時甚至幾天的長度。實驗的*后幾個小時或幾天，連續依靠壓電致動器的反饋系統可能會受到機械漂移或滯后或蠕變由于定位不一致。在短期的實驗中，這些文物的影響通常可以忽略不計，但在長時間的收購，他們的貢獻可能是顯著的。

總之，解決問題的焦點漂移也許是*重要的進步，在*近的歷史上已經發生的活細胞成像。此工件必須始終在一個實驗系統的結構的設計的時間推移成像更為明顯，當使用高數值孔徑物鏡窄的焦點深度可以很容易地轉移絲毫的振動或變化的溫度處理。焦點的漂移也是一個關鍵因素（以及一個相當大的挑戰），以消除成像時，一個復雜的序列，在一個單一的試樣在每個時間間隔的側向和軸向位置。在大多數情況下，從顯微鏡制造商提供的新焦點的漂移補償系統能夠提供良好的校正，但在不同的水平速度。然而，無論儀器的復雜程度，與活細胞進行延時實驗時，必須密切關注支付漂移上述因素，包括熱的環境中，試樣攝像室，振動，浸沒介質，穩定性和機械穩定性。一旦所有的基本細節已經得到解決，應謹慎調查以優異的成績回報。