尼康顯微鏡：三色成像激光掃描共聚焦顯微鏡的方法及應用

激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）通常用于產生數字圖像的單，雙，三熒光標記的樣本。使用紅色，綠色和藍色（RGB）顏色的信息用于顯示多達三個標記細胞的熒光探針，任何共定位觀察到不同的加色的彩色圖像時，合并成一個分布單三色圖像。

在本節中，我們提出了生產三色共聚焦圖像，采用了時下流行的圖像處理程序，Adobe公司的Photoshop先前公布的方法的簡化版本。此外，多個應用程序的顯示共聚焦圖像的三色的合并協議進行了討論。請注意，這些數字化的方法不局限于使用激光掃描共聚焦顯微鏡的圖像，并可以適用于導入到Photoshop中的數字圖像，從許多不同的來源。

熒光標記的樣本圖像使用一個型號Bio-Rad公司MRC-600激光共聚焦掃描系統，收集用人前面描述的方法在文獻中。選定的圖像共聚焦顯微鏡微電腦主機轉移到另一臺計算機的二進制文件。圖像被直接導入到Adobe Photoshop中，無論是作為純二進制文件（RAW）或標簽圖像文件格式（TIFF）文件。在RAW文件的情況下，共焦圖像的實際尺寸必須被輸入，例如，一個典型的圖像大小為768×512像素，與一個76個字節的頭。標題是特定的Bio-Rad公司專有的PIC文件格式，并從不同的公司可能會隨成像系統。這種信息的圖像文件應免費提供從各焦公司。相比之下，TIFF文件直接導入到Photoshop中打開。如果有必要，共聚焦圖像文件可以轉換為TIFF文件使用市售的程序設計操縱聚焦的文件或其他軟件，如NIH圖像，這是在互聯網上提供下載。存在的一些方案，共聚焦圖像，可用于進一步的處理。

產生三色的圖像在Photoshop，粘貼各共聚焦顯微鏡觀察到紅色，綠色和藍色通道的RGB彩色圖像的灰度圖像。在下面的描述的過程中，包括在Photoshop程序內的各種命令的位置（用斜體表示）后，每一個操作。不同版本的Photoshop可能使用略有不同的命令結構，特定的命令或菜單位置，進行相同的操作。在一個特定版本的具體操作上更多的詳細信息可在Photoshop的用戶指南。

一旦三個灰度圖像在Photoshop中打開，構造一個空白的RGB圖像（文件，新建）。圖像必須為相同的尺寸和像素的分辨率為原來的三個灰度圖像的共聚焦顯微鏡，在這個例子中，768×512像素和72像素/英寸。可確定的大小和分辨率的圖像調整（圖像，圖像大小）。這種新的RGB圖像應該是黑色的，因為在熒光圖像的背景通常是非常接近或黑色（黑= 0，白色= 255）。可以選擇另一種顏色的背景以美容為目的，但實際劃定的圖像區域的黑掩模的結構應能夠與實際的圖像中的信息的新的背景顏色不會干擾。

如果尚未打開，打開“ 通道“調板中應該在這個時候（“ 窗口“，顯示頻道）。三個灰度圖像，現在準備將其粘貼到新創建的RGB圖像。這是通過選擇*灰度圖像（選擇所有），并將其復制到新的RGB圖像（編輯，復制）所需的紅色，綠色或藍色通道，通過點擊在新創建的RGB圖像，并用鼠標然后在“ 通道“調板中列所需的通道。例如，對于紅色通道，點擊紅色窗口在列。*后，灰度圖像粘貼到RGB圖像（編輯，粘貼）。圖像現在將出現在“ 通道“調板中列在紅色和RGB通道。正在選擇的第二和第三灰度圖像，復制和粘貼，分別為綠色和藍色通道的RGB圖像，使用相同的例程。這些操作的結果是一個單一的三色合并后的圖像（圖1（a）和（b）條），這是通過雙擊在頻道調色板列的RGB圖像上顯示。有從三個原始源圖像的位深度的信息沒有損失，因為3個8位的圖像合并成一個單一的24位圖像。的圖像顯示在圖1中的果蠅胚胎分別在三個不同的激發和發射波長，然后將其分配給不同的顏色通道，使用Photoshop產生三色的合并后的圖像的兩個版本的相同的三個采集圖像的創建。

在合并后產生的圖像的色彩層次可以改變使用水平（圖像，調整，色階）獨立調整紅，綠和藍色值的圖像。*后，對于呈報而言，圖像的亮度和對比度（圖像，調整亮度/對比度）是微調。可以查看和選擇圖像的微妙變化，利用變化（圖像/調整/變化）。在這個時候使用嵌套在Photoshop中的圖像處理功能，可以實現很多額外的操作。特別有用的功能允許除了圖形和匯編成多屏顯示的數字圖像。圖形其后更方便的編輯，如果他們被粘貼到一個單獨的層中的圖像，而不是永久地取代實際圖像本身的像素。

圖像保存到計算機的硬盤，選擇另存為（文件，另存為）。TIFF格式的圖像通常保存在壓縮使用的Lempel-Ziv的韋爾奇（LZW）計劃，這是完全損失。聯合圖像專家組（JPEG）壓縮其他的壓縮方法，如可以引入文物可能更加復雜，每次被重新存入一個文件。*終圖像存檔到CD-ROM或DVD-ROM。

彩色硬拷貝的圖像可以直接從Photoshop中使用一個高分辨率的數字彩色幻燈片機或數字熱升華打印機或其他顏色。這些設備是從Photoshop插件，避免了需要將圖像傳輸到另一個程序尚未直接控制。詳細方面的海量存儲和編制的硬拷貝已在*近的文獻中廣泛檢討。單色圖像往往缺乏對比上熱升華打印機打印時。某種程度上，這個問題可以克服，由生產單一的RGB圖像，因為在此之前，調整三個通道的相對水平，因此有資料打印的所有通道（圖像，調整，色階）。

對于合并兩個圖像，使用這種方法，第三通道空置。早期版本的Photoshop需要使用一個空的或黑色的，用于第三通道的空白背景圖像的紅色圖像的紅色通道，綠色圖像的綠色通道，在藍色通道的RGB圖像的空白圖像以產生一個紅/綠雙標簽圖像。使用3.0.5版的Photoshop（或更高版本），可以粘貼到一個新創建的黑色RGB圖像灰度圖像。例如，要產生一個紅/綠圖像，單獨的圖像粘貼到紅色和綠色通道（圖2（a））。

為清楚地輸送收集的生物信息，通過共聚焦顯微鏡內的三色的合并后的圖像的顏色的組合是很重要的。兩個*常用的熒光團的真正的發光顏色，若丹明，熒光素，是便利，紅色和綠色，分別重疊域的表達是黃色的。這些都是用肉眼觀察顏色，配備適當的過濾器套同時雙標成像，這是現在大部分的顯微鏡制造商在傳統的落射熒光顯微鏡。需要注意的是在一個三重標簽樣品制備的共聚焦分析的第三信道通常在遠紅外發射，例如菁（Cy5標記），這是方便地顯示為數字圖像中的藍色，而往往是極其困難的真正的Cy5的排放可視化的眼睛和不那么容易描繪的數字圖像。

使用Photoshop，它是一個相對簡單的任務，實驗的各種顏色組合成不同的渠道重新排列圖像。圖1中顯示的三色合并圖像的兩個版本作為參考。的檢體是一個果蠅胚上面的蜂窩胚盤階段，三重標記的三個分割蛋白：毛在綠色（圖1（a））或紅色（圖1（b）），藍色（圖1（a） ，目前已知共有*過20種KLFs的）或綠色（圖1（b）），巨紅（圖1（a））或藍色（圖1（b））。不同版本的實現清理組件不同渠道使用分離通道（“ 窗口“，顯示通道，通道面板的下拉菜單中，分離通道）和重組合并通道（通道面板下拉菜單的圖像灰度圖像的RGB三色圖像合并通道，RGB顏色模式）。使用指定頻道的輸入框，該組件灰度圖像可以被分配給不同的信道的RGB圖像。因此，顏色并不一定對應的試樣的實際顏色。

額外的顏色可以通過將兩個版本的相同的圖像，所述第二圖像中的第三信道合并成兩個，三個通道的雙標簽圖像中包括。例如，紫色和綠色的圖像所產生的相同的圖像粘貼到紅色和藍色通道，得到紫色，并且被放置到所述第二圖像的綠色通道（圖2（b））。附加的顏色組合是紅色和淡藍色，淡藍色包括藍色和綠色通道;或藍色和黃色的，其中包括紅黃色和綠色通道（圖2（c））。在此，重疊的表達總是顯示為白色的圖像中的時間向所有三個通道的重疊信號（圖2，（b）和（c）項）。不同的顏色組合表現出這里利用一個果蠅三齡翼成蟲盤標本雙標無翅，紅色，綠色，或藍色（圖2（a）至圖2（c）），綠色，紫色achaete，或黃色（圖2（a）至圖2（c），分別）。這些額外的色彩組合時，可以使用多面板的數字*過三種蛋白質的表達模式的圖像顯示在單獨的面板，讓不同的顏色分配給每個蛋白質的幾個雙標。請注意，細胞核，共表達無翅及achaete的顯示在圖2（a）和白在圖2（b）和圖2（c），為黃色。

這種合并共聚焦圖像的方法被廣泛用于映射雙重和三重標記標本中的大分子分布。由于絕妙的特異性免疫熒光法，很多的圖像時是相當抽象的視為單一灰度圖像，在許多情況下，當第二或第三圖像的組織內的公知的地標顯示在同一時間只能被解釋。這是典型的核標記的熒光原位雜交（FISH）。這些圖像通常由相對較少的明亮像素大多是黑色的背景上，只能解釋當第二個，復染的形象與明亮的彩色雜交中心的整個細胞核或染色體蔓延收集和合并的圖像。污漬如YOYO-1（激發*大值491納米）或TOTO-3（激發*大值642納米）的二聚核酸*counterstains為這些目的。近日，已*過三探頭定位于同一染色體組合標記策略。在這里，更復雜的計算機圖像合并和測量方法已經發展到在影像中顯示的生物信息。

多標簽的是共焦成像發育生物學家研究細胞譜系的一個，或有時兩個分布，蛋白質可以作為地標映射顯影組織內的第三感興趣的蛋白質的克隆和分析一個**的工具。此外，熒光標記的鬼筆環肽是一個方便的探頭包括在成像細胞輪廓的三重標簽策略。染料的具體組合，例如羅丹明鬼筆環肽標記細胞的輪廓，TOTO-3標簽核（Cy5的通道），以及抗體，該抗體的蛋白質的感興趣（熒光通道）可以用在一個三標簽策略映射到細胞核的蛋白質的位置，到細胞質中，或細胞外基質。

除了 顯示多達三個不同的大分子在細胞內的相對分布相結合的三幅圖像，這種方法可以用來作為一種替代試樣內的顯示深度信息的三維（3-D ）重建。使用激光掃描共聚焦顯微鏡，一系列的圖像不同的焦平面內的試樣收集到一個單一的文件或z系列。這些圖像保持從檢體的x，y，和z登記，并具有相同的尺寸和像素的分辨率。三幅影像選自這樣的z系列，導出為單一圖像文件到Photoshop，然后將它們合并和以前一樣，使紅色，綠色和藍色的顏色被分配給在不同的深度范圍內的試樣（圖3（結構一個）和（b））。以類似的方式，單個圖像可以提煉出三個不同的時間點收集的共聚焦顯微鏡并結合成一個三色的合并后的圖像的隨時間推移的電影序列文件。這些文件是z系列的文件類似，不同的是時間已取代z維度。在這里，顏色差異是用來總結的位置結構的變化，隨著時間的推移在一個單一的形象。

在圖3（a）所示的圖像合并三個圖像從彩色顏色是編碼，使試樣中的深度的Z系列投影的結果。上皮細胞核顯示為綠色與規模形成在藍色和紅色在不同級別上皮細胞的細胞核。標本是一個整體安裝蝴蝶蛹翼上皮細胞用碘化丙啶染色。在圖3（b）中，不同的結構在一個雙標簽圖像映射到深度比圖3（a）一個整體安裝在稍晚的發展階段的蝴蝶翅膀上皮。細胞核被標記為與TOTO-3，和在更背側的位置在上皮細胞核的新興鱗翅與得克薩斯紅鬼筆環肽標記。

Photoshop中還可以提供一個進一步的處理的圖像文件是兼容的，因為與許多其他程序的橋梁。例如，發展的共聚焦圖像序列已使用Photoshop處理，隨后轉移到市售的變形程序，加工成短動畫序列的發展。這些序列可以進一步編輯和編譯使用Adobe Premiere視為使用蘋果的QuickTime軟件，直接在電腦上（以及其他適用的軟件可以用來）數字電影，用于演示目的或導出到錄像帶上。

Photoshop是可用于許多不同的計算機平臺，并可以運行在大多數的共聚焦顯微鏡主機電腦。一些更復雜的共焦成像系統是能夠收集，合并和使用三個檢測器的系統，該系統能夠消除Photoshop的使用，同時上色三個圖像。但是，它通常是需要使用額外的實驗室微型計算機操作以便騰出共焦工作站，它的主要目的，采集圖像的共聚焦圖像。此外，用于編譯的*后數字，它可能有必要在*終的板從其他來源的圖像相結合共聚焦圖像，并且在這種情況下，一個單一的圖像處理程序，可以用在許多不同的實驗室計算機的通用性是非常寶貴的。