徠卡顯微鏡，FLCS - 熒光相關光譜進展
在單分子水平的表征物質已成為的標準劇目科研院所的一部分。*常用的方法之一，是熒光相關光譜（FCS），它可以用來檢查的動態性和在溶液中的熒光分子濃度。本文介紹了一種測量技術，結合了經典的FCS測量與時間相關的單光子計數，以獲得更精確和可靠的結果。
FCS是經常被用來研究的分子在溶液中的動態過程。然而，實驗因素嚴重影響的分析，如FCS數據記錄。典型的因素包括工件的測量系統中，雜散光的熒光基團的三線態，雜質或背景的樣品。由于這些因素不是恒定的，但樣本間差別很大，一個FCS實驗的分析往往是問題，而且容易出錯。因此，*好是根據物理定律，然后再執行一個特定的數據分析來清潔數據記錄。
遵循一個明確的數學分布概率的物理值，熒光衰減。這里所描述的方法，熒光壽命相關光譜（FLCS）使用清潔FCS數據集的熒光衰減行為。FLCS可以使用，例如，以消除工件的測量系統或單獨的數據記錄從一些熒光基團的混合物，然后可以逐個進行分析。這種類型的評估產生明確和可重復性的結果，即使是*小的熒光濃度。
單分子光譜
在七十年代推出的熒光相關光譜的原理描述了在橢球體積溶液中單分子熒光研究。結合共聚焦顯微鏡，，FCS已成為一個重要的測量方法，為研究分子動力學和濃度。
在一個FCS的實驗中，典型的連續的激勵光聚焦到一個點在紙巾或溶液。通過使用共聚焦設置時，可以觀察到分子內的體積為約0.3毫微微升（圖1A）。此卷是由激發和發射波長，客觀和共焦針孔的大小。
實驗本質上是基于布朗運動的分子擴散通過檢測量，很高興和發光。測量的對象是由此產生的熒光強度隨時間的變化（圖1B），然而，可能的影響，以及由其他光物理過程。
分析FCS的數據的*個步驟是從測得的熒光強度，計算出的自相關。然后，一個合適的模型函數的變參數裝配到所得到的自相關函數（ACF），從其中，例如，所產生的熒光團濃度或擴散常數。ACF進行分析時，所面臨的挑戰是找到一個合適的模型描述不僅實際性能的熒光，也影響實驗因素與可變參數函數。每個額外的影響需要至少一個附加的參數的復雜性和分析的傾向，因此，包含錯誤增加。如果樣品有一個以上的熒光基團，每個熒光團的擴散行為影響所得的ACF，這不是一個簡單的線性組合的情況，而是一個復雜的各個信號的疊加。
圖 1：插圖的FCS實驗。（A）測量體積（深藍色）的聚焦激光束在聚焦。（B）上記錄一個FCS數據記錄和計算的自相關函數的熒光強度的波動的。
不同的方法
多年來，已經建立了各種版本的FCS來處理的與ACF的分析相關聯的問題。所有這些方法的目的是清潔背景工件的數據，并允許同時研究一些熒光的分子。
*常用的方法是熒光互相關光譜法（FCCS），在其中的熒光，同時記錄與兩個檢測器。探測器后脈沖的*常見的實驗工件之一，例如，可以消除與FCCS。這是一個的幻像脈沖發生在檢測器的反饋所造成的在測量過程中。分配相等的部分所發射的光子在兩個檢測器上，然后從兩個數據記錄計算出的互相關的干擾信號被刪除。
FCCS還允許具有不同的光譜發射波長的熒光團分離，從而使單獨的數據分析用于確定擴散常數和濃度。除此之外，交叉的兩個信號的相關性提供了一個潛在的相互作用的分子受調查的信息。然而，實驗裝置的復雜性，不應該被低估。單獨檢測的熒光基團的檢測量有重疊的100％，這是由于檢測音量大小的激發和發射波長的依賴性非同小可。此外，*光譜分離的熒光可以經常不實現，這反過來又使數據記錄的分析更加困難。
數學的其他方式的數據分開，實例中的擴散系數的差別的基礎上。然而，必須不同的分子的擴散系數（至少）1.6，得到有用的結果的一個因素。因此，這種測量方法并不分子濃度或擴散常數進行簡單的閱讀，而是基于高度復雜的數學擬合的ACF，包括假設一般不可能通過實驗證明，因此極其容易出錯。
通過時間相關的單光子測量的改進
熒光壽命相關光譜的方法，可以規避上述問題。FLCS實驗中，不僅熒光強度的時間變化，而且還有具體的一個脈沖激發后的熒光基團的熒光衰減行為的測量，然后用于清洗的FCS數據記錄。FLCS，而不是假設的測定數據的分析，基于純數學的評價方法。
基本上，FLCS FCS和時間相關單光子計數（TCSPC），這是*適合的方法，用于測量單個分子的熒光衰減行為的組合。TCSPC需要的脈沖激勵激光器和單光子靈敏的檢測器。
實驗原理
對于FLCS實驗，TCSPC測量是在一個特殊的“時間標記的時間分辨”（TTTR）測量模式。在這里，兩個相互獨立的為每個檢測到的光子的時間的測量：首先，在激勵脈沖的發病和到達的檢測器信號（微觀到達時間）以皮秒分辨率，其次從實驗開始時的時間之間的時間注冊的特定的光子（宏觀到達時間）。
的微觀的到達時間被用來產生一個的TCSPC直方圖，描述了特定的熒光衰減行為。就像在任何經典FCS實驗宏觀到達時間可以用來計算出的熒光強度隨時間的變化，并確定通過計算的ACF的擴散系數和濃度。
對于一個FCS的實驗中，熒光團的混合物連續激發，也有一定的概率為每個檢測到的單光子發射的熒光團或熒光基團B.這個概率是恒定的時間，因為沒有定義的時刻激發。FLCS是基于一個簡單的事實脈沖激發產生激發一個特定的時間，這意味著一個光子所發出的熒光基團A或熒光基團乙變化的時候（圖2A）的檢測概率。檢測到的光子激發后不久可能發射的更快的衰減的熒光基團（壽命變短），，而晚光子更有可能被發射的速度較慢的衰減熒光團（更長的壽命）。隨時間變化的檢測概率的基礎上，有數學方法可以應用到統計概率原產概率分配的過濾器，每個光子的到達時間（圖2B）。
圖 2：（A）兩個熒光基團的熒光衰變行為A（紅色）和B（藍色）以及混合物（黑色）。（B）分配給每個光子的到達時間與從熒光團發射的光子的概率統計濾波功能A（紅色）或B（藍色）。
要設置一個合適的分配濾波器，對應的直方圖的構成成分是必需的，除了TCSPC測量本身的直方圖。如果，例如，人們希望分開的熒光基團，TCSPC直方圖純熒光團是必要的。要刪除不帶熒光基團的雜散光成分的測量，一個額外的測量是必要的。分布過濾器，然后分配給每個光子的光子的概率來源于特定組件的抵達時間。因此，此數據分離發生在單光子水平。分離的數據記錄可以彼此獨立地進行分析計算ACF。
這種類型的統計分析不僅適用于所檢測的熒光團的排放量，但同樣適合用于描述工件的測量系統，例如暗計數率和后脈沖檢測器（圖3A）。關于這一主題的文學已經包含了成功的例子分裂的測量數據記錄到多達4個的子組件。
一般來說，它是重要的，FLCS要注意的是使用分離的和整個熒光衰減行為，可確定從它的平均熒光壽命。可以在數學上彼此分開的熒光基團或組件，如果他們顯示在的TCSPC直方圖的不同的配置文件。
示例應用
的功能性，有效性和穩定性的FLCS方法已被證明在極其廣泛的應用范圍，不僅在體外而且在體內。即使在簡單的分析只有非常小的熒光染料濃度的FCS的實驗中，使用FLCS導致更高的精度和再現性分子濃度和擴散速度的測量。圖3示出FLCS測量的染料Atto655，溶解在乙二醇。由于大的雜散光成分在低摩爾的解決方案中，只有約60％的檢測到的光子起源從染料，其中所確定的熒光團濃度有負面影響。在比較有和沒有生命周期的濾波的數據分析的自相關曲線（圖3C），可以看出，通過消除測量的背景，其中包含雜散光系統構件（圖3A 和圖3B ，紅色線），遠小的分子數被檢測到，構成設定的分子溶液的濃度（下午10點）的良好近似。該方法也被體內的小區的測量，其中FLCS用于去除來自數據記錄 在單元格中存在的黃酮類和NADH分子施加巨大的成功。
在法國巴黎狄德羅大學的的實驗室Ma?té酒店Coppey穆瓦桑*近能夠證明，它也有可能在體內 FCCS實驗，以除去在與熒光蛋白GFP和mCherry的的mCherry檢測通道中的綠色熒光蛋白的光譜串擾。在這里，在GFP激發用脈沖激光和連續波激光的mCherry。這使一種蛋白質相互作用研究的ACF沒有數學擬合。
圖 3：FLCS實驗系統特定的測量工件內的影響和消除。（A）的TCSPC直方圖染料的Atto655的溶于乙二醇（黑色）10日下午，在水（100分，藍）和背景（紅色），純Atto655的。（B）的統計過濾功能分配給每個光子的到達時間的光子來源于熒光團（藍色）或背景（紅）的概率。發射Atto655檢測到的光子的概率增加的延遲時間越長。（C）的自相關函數（黑色）和（紅色）壽命過濾FCS數據集的記錄。
總結
FLCS是一個復雜的方法確定分子的濃度和動力學。由于其物理法，熒光衰減行為，或許可以用一個統計分布的概率，這是很有用的分離的測量數據和清洗工件的FCS數據記錄。FLCS從而使分子的濃度和擴散時間更精確和可重復的決心。這反過來又導致生成的數據之間的可比性，不同的測量系統之前，現在這是不可能的。