熒光顯微鏡技術
熒光物質 ( 熒光染劑 ) 受到較短波長的光 ( 如 FITC : Ex:488 nm ) 及足夠的能量所激發, 當要回到穩態的能階時, 會釋出較長波長的熒光 ( 如 FITC : Em : 515 nm ), 非熒光物質則成為黑色的背景.
自體熒光 ( auto-fluorescence )又稱為主要熒光 ( primary fluorescence ), 是物質本身無熒光染劑也能自體產生的熒光現象., 一般, 此種熒光會影響實際要觀察的樣品, 或者, 其自體熒光會干擾覆蓋實際要觀察的熒光, 讓我們無法真正的判定熒光產生的物質及部位在那里? 所以, 利用特定的熒光染劑來表現特定的物質與部位, 此種由染劑所釋出的熒光, 我們一般稱之為次級熒光 ( secondary fluorescence )
顯微鏡的熒光影像技術取決于下列主要因素 ( 除了顯微鏡本身光學系統的優劣之外 ) :
1). 樣品處理
2). 熒光染劑 ( Fluorochrome = Fluorescent dye )
正確的選用熒光染劑, 必須將背景洗凈, 注意其熒光漂白時間, 也須留意其酸鹼值的變化.
新一代的染劑愈來愈多, 如 Multi-color GFP, DsRed, nanocrystal… etc. 在使用時, 必須特別注意所匹配的激發光源及感測的光譜范圍.熒光感測是仰賴感測光子的多寡. 愈多光子 ( Photon ), 熒光影像愈佳.
3). 激發光源 ( Light sources )
一般使用于熒光顯微鏡的激發光源有高壓汞燈及高壓氘燈
高壓汞燈 ( Hg 50 W – 使用交流電 及 Hg 100 W – 使用直流電 )
高壓汞燈Hg 50 W一般都用于綠色或藍色的光譜范圍. 然而, Hg 100W 能提供更為穩定的
光源, 所提供的強度更為均勻., 較適宜光譜定量分析應用.
高壓 Xenon燈 ( Xenon 75 W – 使用直流電)
高壓 Xenon燈能提供穩定的電流, 在連續的可見光光譜范圍, Xenon燈提供較固定的光源平均強度.
所以, 一般都使用 Xenon燈于 UV, Violet 及其綠色或藍色的光譜范圍.
燈泡式的光源缺點之一即是 :
光源都是全光譜分布, 每一波長的光源, 其強度都不是恒定, 且能量較低也不均勻分布, 光
源強度也無法調整. 故, 樣品及染劑的應用上, 頗難達到理想的控制.
共軛焦顯微鏡所采用的光源是雷射 ( Laser )., 波長純一, 高能量.
4). 熒光濾鏡 ( Fluorescence Filter Cube )
每一組熒光濾鏡基本上都包括了三個鏡片
1). 激發光濾鏡 ( Excitation Filter )
因為特定的染劑需要使用特定波長范圍的光來當作激發光源 ( 才不致影響到其它不想要檢
視的物質被激發 ) 而一般燈泡式的光源 ( 如 Hg 50W, Hg 100W, Xe 75 W ), 所產生的光, 都含
蓋全波長 ( 300 – 1200 nm ) , 所以, 必須使用激發光濾鏡來篩選激發熒光染劑所須的光譜范圍
( 可為 Long-pass, Band-pass, Short-pass ). 激發光濾鏡是以特殊的鍍膜, 來產生可篩選波長的
功能. 例如 BP 450 – 490 nm, 即是僅讓 450 – 490 nm 間的光通過, 用以激發 FITC 染劑.
2). 分光鏡 ( Dichromatic Mirror 或者 Beam Splitter )
將較短波長的激發光反射至樣品.
例如 RKP 510 nm, 即是, 510 nm 以下的光反射至樣品, 然而, 510 nm 以上的光可通過.
3). 釋放光濾鏡 ( Emission Filter 或者 Suppression Filter )
受檢樣品中的特定染劑及其它物質被激發后, 所有被激發的物質都釋放出來較長波長的螢
光, 然而熒光僅能在釋放光濾鏡所選定的特定波長范圍內通過, 此通過的熒光即是我們所要
觀察的熒光影像.
例如 : LP 510 nm, 即是, 熒光光譜超過 510 nm 的, 都能通過濾鏡供觀察, 低于 510 nm 的螢
光則被阻擋看不到.
傳統的共軛焦顯微鏡所采用濾鏡轉盤 ( Filter wheel ), 其內可安裝感測光濾鏡.
Leica TCS NT2 于每一個 PMT 前, 皆可安裝 1 組濾鏡飛輪, 每一個飛輪可安裝最多達 7 個
的濾鏡.
Leica TCS SP 則是以連續式的全波長分光光譜系統來取代傳統的濾鏡, 因為, 有限的濾鏡無
法滿足染劑的應用, 更無法滿足新一代染劑的使用. 使用可全波長感測的分光光譜系統, 可
無限制的自訂各種感測光譜, 有如一組無限的濾鏡. 真正達到多工多用途與多使用者的目的.
5). 光學鏡頭解析
鏡頭的解析, 是熒光影像質量的重要影響因素之一, 基本上, PL-Fluotar 及 PL-APO 級的油鏡能提供較好的光學穿透率., 其中, 又以較高 NA 值 ( NA 值與鏡頭開口角度 α 成正比 ) 的鏡頭為好. ( 鏡頭必須使用折射率 n= 1.518 immersion oil, 一般鏡頭解析計算, R = n˙ sinα ), 如 : PL-APO 63x/1.32 Oil, PL-APO 100x/1.40 Oil
同樣 100x 鏡頭, 如果使用次一級的 N Plan 100x/1.25 Oil, 則因其 NA 較小, 色差與像差的修正都略遜于 PL-APO 100x/1.40 Oil鏡頭, 故, 熒光影像質量較差., 在低強度的熒光影像鏡檢, 表現更是明顯.
所以, 熒光影像所使用的光學鏡頭依序考量應為 PL-APO, PL-Fluotar, N Plan, C Plan, Achromatic.
共軛焦顯微鏡建議使用專屬的鏡頭, 其于 R, G, B, 各作有特別的修正 ( correction ), 能提供最高的光學穿透與解析 ( Point-spread resolution ). 故, 其有別于一般鏡頭.
例如 : PL-APO 63x/1.32 CS Oil ( 有 CS 標示, 即代表 Confocal System 專屬鏡頭 )
6). 熒光傳感器
基本上, 一般除了利用目鏡 ( Eyepiece ) 檢視之外, 絕大部份都使用相機 ( Camera ) 或 CCD 攝影機 來擷取熒光影像.
由于熒光影像一般都較弱, 故照相時, 依照熒光強度的強弱分布, 可能必須使用俱有點測光 ( Spot metering ) 及 俱有長時間曝光的照相系統為考慮因素., 然而, CCD 攝影機則以大芯片 ( CCD Chip ), 冷卻式 ( Cooled ), 對極低弱的光有較靈敏感應的黑白 CCD 攝影機為考慮因素.
使用黑白 CCD 攝影機的原因之一是其比一般彩色 CCD 攝影機感光較為靈敏, 顯像解析較高.
如要取得彩色熒光影像, 則可通過影像擷取卡 ( Frame Grabber ) 取像, 以數位影像方式, 利用軟件作 RGB 三原色套色即可 ( 一般, 利用 Photoshop 軟件, 即可處理彩色套色 ). 如要直接擷取實彩色熒光影像 ( True Color Image ), 則可加裝 RGB-濾鏡 即可.