徠卡顯微鏡FRET與FLIM定量在體內生物化學
熒光壽命是多久熒光團保留在平均在激發態通過發射熒光光子返回到基態之前的量度。它依賴于熒光團的分子的組合物和納米環境。
FLIM結合壽命測量與成像：為每個圖像像素獲得的壽命是顏色編碼，以產生更多的圖像對比度。因此，FLIM有關其生化狀態或納米環境的信息提供關于熒光分子的空間分布的信息一起。FLIM的一個典型應用是FLIM-FRET。FRET是一個行之有效的方法來研究分子間的相互作用。它審視蛋白結合，并估計在一個規模埃距離間也。
FRET - 原理
熒光共振能量轉移（FRET）描述的能量存儲在激發的熒光分子（供體），以非激發不同的熒光分子（受體）在其附近的非輻射轉移。 三個條件必須滿足FRET發生：
圖1：供體（ECFP這里，藍線）的發射光譜必須與受體的激發光譜（這里EYFP，黃線）重疊。這個要求意味著兩個分子在FRET對具有兼容的能量水平。
圖2：供體分子（D）是通過從受體分子（A）的距離為r隔開。
圖3：在距離r小于閾值R 0，也稱為福斯特半徑大得多，沒有能量傳遞。
圖4：如果分子處于緊密接觸能量從激磁光子（藍色箭頭）被傳非輻射到受體。 反過來，后者發射光子（黃色箭頭）。 這個處理（E）的效率強烈地依賴距離為r -6。
影響
由于其隨r強距離相關-6（圖4）的FRET發生在一個空間尺度是用于生化反應，如蛋白質-蛋白質或蛋白質-DNA相互作用高度相關。 FRET可以通過靈敏的熒光讀出探測分子間的相互作用。 這使得研究人員研究在體外和體內分子間的相互作用。通過將與適宜的熒光標記感興趣的兩個相互作用配偶能夠分析雙分子相互作用。可替代地，FRET允許生物探針報告的第二信使或離子強度由分子內FRET的手段濃度的結構，由于強的構象變化。
毫不奇怪，FRET已發展成為細胞生物學，生物物理學和生物醫學成像廣泛使用的工具。
該方法
有不同的技術來檢測FRET在顯微鏡的情況下。俗稱的基礎上無論是供體（受體 - 漂白，FRET AB）或受體（致敏的排放，FRET SE）的熒光強度的技術。
基于強度的FRET可以使用標準共焦顯微鏡可以容易地應用。 然而，它也有一些缺點。FRET AB不能在時間系列實驗被應用并易受可逆漂白的供體分子或光轉化。FRET SE，另一方面，患有光譜串擾固有所有FRET對，需要仔細校準測量以及產生的圖像的線性分解。 本申請書介紹了一種不同的方法來測量FRET是基于熒光壽命成像顯微術（FLIM）。
熒光壽命
熒光的過程常常被理解分子中（圖5，左）從電子基態（S 0）到激發態（S 1）項的能量轉換。這種轉變可以由入射光與適當的能量（即頻率或波長）被引出。 所吸收的能量被熒光分子存儲短時間才可以發出熒光。一個分子在其激發態的時間被稱為熒光壽命。 它典型地在納秒（10 -9秒 ），用于許多有機染料和熒光壽命蛋白質的順序。
熒光壽命和FRET
另一種方法，以放松從激發態是，例如，FRET。通過FRET激發能量是非輻射地轉移到受體分子。反過來接受器可以通過熒光（圖5，右）放松。 由于供體熒光和能量轉移是競爭過程的消耗率的激發態增加FRET的存在。有人可能會說，時間越長，供體分子度過處于興奮狀態就越有可能的是，FRET發生。 僅僅從供體分子的光子通過它放松熒光觀察。能量轉移到受體分子不因受體熒光的波長更長的檢測。 因此，FRET縮短壽命捐助（圖6）。
圖5：在FRET對能源的過渡。 光能匹配的供體分子的過渡被吸收（藍色箭頭）。 興奮的捐贈者可以放松或者通過熒光（灰色虛線箭頭，左）或共振能量轉移到受體分子（黑色箭頭）。
圖6：激發后繪制的熒光光子數在經過時間。 激勵脈沖后發射的光子的初始數量，一個0，呈指數衰減。 熒光需要時間衰變到一個0 / E（?37％）是熒光壽命。 壽命τ轉移到更短的時間，由于FRET（τ淬火 ）。另一種讀出從壽命衰減幅度為0。在掃描系統中的每個位置測量的壽命產生壽命（見插圖）的空間地圖。
熒光壽命成像（FLIM）
使用脈沖激光器和單光子計數探測器在Leica TCS SMD系列測量在時域熒光壽命。壽命是通過建立檢測熒光事件的直方圖來確定。這揭示了一個單或多指數熒光衰減。 數值曲線擬合呈現熒光壽命和振幅（即，檢測到的光子數）。（
FLIM-FRET
由于FRET減少捐助壽命可以量化到FRET發生時，提供無FRET供體的壽命是已知的程度。這個供體壽命τ用作*參考針對其FRET樣品進行了分析。 因此，FLIM-FRET是內部校準 - 一個屬性減輕許多的基于強度的FRET測量的缺點。因為它的熒光壽命是一種染料的固有屬性是廣泛不變的，否則不利影響如漂白，圖像陰影，不同濃度或表達水平。
主要的使用限制強度基于FRET測量的基本假設所有觀察到的捐助分子發生FRET。這通常不是這樣的。 供體分子的這種變化的“綁定”部分介紹了相當大的不確定性所測得的FRET效率，使實驗無法進行比較。 FLIM-FRET克服了這一缺點。
拍攝使用活細胞圖像FLIM
如前面提到的，FRET效率從微動施主壽命τ 驟冷過的非微動壽命τ作為的比值來計算：
為此τ必須從測量使用包含施主只有一個樣品已知的。 它排除從受任何排放量是很重要的。 使用外部檢測器必須使用一個帶通濾波器。 內部檢測器可被調節以只記錄供體發射。 相同的設置，必須同時用于donoronly測量以及使用FRET樣品的測定。
CFP-YFP FRET活細胞
在這項工作中，我們使用培養RBKB78細胞瞬時轉染了熒光共振能量轉移構建體組成的CFP-YFP的融合蛋白質（圖7）的。 兩個的FP通過兩個氨基酸的短的接頭連接。這樣的供體 - 受體融合也可以作為在真實的場景中一個很好的陽性對照FRET。“捐助*的”樣本包括轉CFP只（圖7A）相同的細胞。 作為*近似的平均壽命是計算在快速FLIM的模式，對于兩個，只有供體和FRET樣品（圖7B）。壽命分布直方圖顯示，供體的平均壽命τ是2.1納秒（圖8）。在FRET結構的供體的壽命是1.4納秒。 其中獲得一個FRET效率E = 1 - （1.4 / 2.1）= 33％。
頂行：圖7：RBKB78細胞轉染與CFP供體只（A）和CFP-YFP融合（B）。 該檢測范圍是使用光譜FLIM探測器設置445-495納米之間。 著色區域已被用于分析。 顏色代表調強熒光壽命。 禮貌教授格雷戈里·哈姆斯，維爾茨堡，德國的大學。 我們承認實驗支持由本尼迪克特克萊默博士（Picoquant，柏林），揚 - 亨德里克Spille和WIEBKE巴克
下排：圖。 8：供體熒光壽命分布只（黃色），并使用平均壽命FRET（綠）的樣品。 還有就是0.7納秒對FRET樣品中壽命較短一個明顯轉變。
FRET的比例與無FRET
它是已知的CFP到具有至少兩個壽命部件在自己的權利。此外，它是不知道所研究的所有分子是否發生FRET先驗。為了公平對待這種復雜性人們需要對*過平均壽命的信息。我們可以進行雙組分配合，這將給我們兩個人的壽命和兩個振幅。后者允許我們估計一個人一生中的相對比例比其他。 特別是，使用的振幅，我們可以估算該分數表現出FRET（結合級分）和未表現出FRET（未結合部分）的級分的相對比例。 fps的微弱第二部分，如EGFP或藍寶石非常適合這種類型的分析。