奧林巴斯顯微鏡的對比度

奧林巴斯顯微鏡的對比度

當成像標本在光學顯微鏡下，在強度和/或顏色的差別創建圖像的對比度，它允許單獨的特征和試樣的細節變得可見。 對比度被定義為在圖像和鄰近的背景相對于整個背景強度之間的光強度之差。 在一般情況下，0.02（2％）的最低對比度值是需要由人眼分辨的圖像和它的背景之間的區別。 對于其他檢測器，如電影，視頻攝像機，或光檢測器（CCD和CMOS器件），最小對比度往往是不同的值。 與每個檢測器中，信噪比（噪聲是所有的光學系統缺乏圖像信息的光的）必須足夠大，以連貫圖像的形成方面來解釋。

通過光，亮度，反射率，雙折射，光散射，衍射，熒光或顏色變化的吸收，在檢體產生的對比度已經在明場顯微鏡成像樣品的典型裝置。 細節的脫穎而出映襯或其他鄰近的細節的能力是標本對比度的量度。 在一個簡單的公式計算，對比度可以被描述為：

其中I(b)是背景的強度，I(s)是檢體的強度。 從這個等式中，顯而易見的是，樣品的對比度是指圖像中的最高和最低強度之間的關系。 在圖1中所示的曲線示出背景亮度對對比度的影響。 當背景是很暗灰色顏色（I(b)等于0.01），在圖像強度的小變化會產生大的變化的對比。 通過減輕的背景有點淺灰色（I(b)等于0.10），在圖像亮度的微小變化提供對比一個有用的范圍。 在仍然較亮的背景顏色（I(b)>0.20），圖像的對比度是相對不敏感的背景強度和大的變化I(b)只產生小的增加或減少中的圖像對比度。

雖然在現代顯微鏡發現該光學系統可以是能夠以高倍率制造高清晰度的圖像的，這種能力是毫無價值沒有足夠的對比度的圖像中。 反差不是標本的固有特性，但是依賴于試樣的光并耦合到其可靠地記錄該圖象信息用的檢測器的能力的光學系統的效率的相互作用。 在顯微鏡的光學系統的圖像對比度的控制，取決于幾個因素，孔徑光闌的主要設置，像差的光學系統中的程度，所使用的光學系統的對比度，檢體的種類，和光學檢測器。 有幾個網站，在顯微鏡下，允許調整對比度。 這些包括字段光圈，聚光光圈，額外放大倍數為視頻檢測器，電子照相機伽瑪，膠片伽瑪，印刷紙伽瑪，圖像處理的實時，以及檢體染色。

因為人眼感知一個目的是通過在其圖像中產生的對比度，可以很容易地引入歧途除非有發生，以產生所述圖像中的對比度的光的事件的知識。 圖2示出了包含根據不同的對比度模式成像用光學顯微鏡透明，無色人類頰細胞相同的視場的3顯微照片：明場，相差和霍夫曼調制對比。 這是很明顯的是，三個圖像出現不同，并且由于這些變化，一個顯微鏡可能在從各視場不同的結論。 在圖2（a）中示出的細胞進行成像用顯微鏡在明場模式下操作與聚光鏡光圈關停足以使試樣邊緣可見。

使用相差光學面頰細胞相同的視場示于圖2（b）。 注意暗區域內和周圍的物體的邊緣明亮外區域，如細胞膜和細胞核（稱為光暈，并且是偽影）。 在此視圖中，很難以指定的細胞的邊緣和解釋的圖像中的暗區和亮區的原因。 該細胞也顯得比較平淡。 最后，在圖2（c）所示的單元使用霍夫曼調制對比，其中圖像的一側是暗，而其相對側是明亮的，導致偽三維物體的感知進行成像。 在圖2中的每個視場提供了不同的試樣的圖像，并導致不同的解釋，這只能通過了解如何在顯微鏡中創建這些圖像被破譯。

對于許多標本在光學顯微鏡，尤其是未染色或生活材料，對比是如此的差，試樣基本保持隱形不顧物鏡的解決或明確分開細節的能力。 通常情況下，為這樣的標本，而不是通過殺死或用化學染料或固定劑，以改變它們是重要的。 這必然導致顯微鏡進行實驗對比度增強技術對超過一百年，以試圖提高檢體的能見度和帶來更詳細的圖像，而不改變試樣本身。 它是一種常見的做法，以減少低于推薦大小聚光鏡光圈或降低臺下聚光鏡增加標本的對比。 不幸的是，雖然這些演習確實會增加對比度，他們也嚴重降低分辨率和清晰度。

奧林巴斯顯微鏡要考慮的是如何光和物質討論控制在光學顯微鏡下的對比度的方法之前，進行交互的特性是有用的。 負責照亮試樣的光可以是空間相干的，非相干或部分相干的。 例如，光束可以成形在狹縫或環形的形式，和選定波長垂直于傳播方向或在由于偏振單一方向振動在所有方向上可組成。

一些樣品被認為振幅對象 ，因為它們吸收光部分地或完全地，并且因此可以使用傳統的明場顯微術可以容易地觀察到。 別人認為是自然色的或人工染色化學染料的顏色也可以清晰地成像的顯微鏡。 這些污漬或自然的色彩吸收白光穿過的某些部分和透射或反射其他顏色。 通常情況下，污漬相結合，產生對比的顏色，如藍色蘇木染色的細胞核結合粉色曙紅的細胞質中。 它是利用污漬標本不容易吸收光線，從而使這些圖像肉眼可見的普遍做法。

其它試樣不吸收光并且被稱為相位對象 。 因為人的眼睛只能檢測強度和顏色的差異，由于對象的相位變化必須被轉換成強度的差異。 相位標本的特征在于由若干標準，包括它們的形狀（通常為圓形或平的），內部光散射元件，厚度的密度，以及獨特的化學或電的結構特性（共同分組為折射率）。 厚的樣品可以是比較明確的，并且僅包含幾個光散射元件，或者它們可以包含許多散射元件沒有通過光，使檢體有效地不透明的透射照明。 這些標本通常被稱為反射光的標本。

當考慮光的方法，以提高檢體的對比度，考慮能夠被操縱以創建的那些特征的強度變化，使它們可見的試樣的各種特性是有用的。 一個主要的問題是該對象的特征下了一套獨特的情況下，將被改造成一個不同的強度。

樣品的細節和邊緣具有一個大小接近的成像光的波長將衍射或散射光，只要是在試樣和其周圍介質（環繞）之間的折射率的差。 折射率被定義為速度的比值通過空氣或真空通過對象除以光速的點亮。 因為光通過的任何材料的速度小于光在真空中的速度，折射率總是超過1.0標本檢查用顯微鏡的值。 為了解決物體之間的小的距離，并以再現它們的形狀與合理的保真度，衍射光的大角度必須由顯微鏡物鏡捕獲。

由物鏡聚集衍射（或偏離）光必須進入一個銳聚焦在圖像平面中，以產生樣品的細節，如示于圖3.在該圖像平面上，光波包括衍射光發生干涉以衍射光。 光的干擾之后的能見度非常依賴于光照射樣品的一致性，與能見度通過增加一致性比例增加。 在光學顯微鏡下，聚光鏡孔徑光闌開口尺寸控制的光撞擊在試樣上的空間相干性。 減小光闌開口尺寸產生更大的空間相干性。（奧林巴斯顯微鏡）

顯微鏡長期以來依靠降低聚光鏡光圈開口尺寸增加階段標本顆粒和邊緣的知名度。 對比度為振幅對象也可以由聚光光圈的適當的調整提高。 不管它們是否屬于一個幅度或相位標本的小物件，邊和顆粒將衍射光。 僅此衍射光的一部分被由物鏡（見圖3）由于物鏡的數值孔徑限制捕獲。 未收集剩余的衍射光表示丟失的圖像信息。 正確設置聚光鏡光圈開口尺寸為增強標本圖像對比度和引進衍射文物之間的權衡。 這些表現在分辨率，衍射環的疊加，以及其他不期望的光學效應從區域中不在共同焦點試樣始發的損失。 作為衍射極限被接近，圖像的對比度變低為目的的信息變得越來越小，空間頻率變大。

井上和彈簧所描述的圖像對比度的比值標本對比度和在由實際和理想正弦圖像時作為空間頻率的函數作圖的光學傳遞函數（OTF）占據的位置的相移。 的情況下的光的來自試樣的分布變得正弦，光學傳遞函數的模量變得調制傳遞函數（MTF）。 作為空間頻率的增加，調制傳遞函數減小和標本的對比度降低。

對于每一個物鏡，具體的調制傳遞函數是依賴于物鏡的設計和數值孔徑，對比度生成，照射光的波長的模式，和臺下聚光鏡的數值孔徑。 物鏡后側焦點面的邊緣作為一個低通濾波器，用于衍射光，它必須被聚焦在圖像平面為干擾發生并形成顆粒或邊緣的圖像。 聚焦顯微鏡帶來這些衍射光波一起在中間像平面。 的光的波前相對于所述檢體的角度決定的難度在側重于光滑圓形表面，其通常含有無衍射部位的頂部或底部的程度。然而，球形標本或纖維的邊緣容易集中，因為邊緣接口是在足夠的角向波前和衍射的光。

當討論相位標本，我們將定義一個對象作為檢體的任何解析部。 如示于圖4。在該圖中的許多對象將是平的或板狀，該對象具有一厚度（t）和折射率，N（S）。 周圍介質的折射率為n(m)。

光行進通過與光路的檢體，OP = t(n(s))，并通過與光路周圍的媒體，OP = t(n(m))。 光程差（OPD）可以表示為：

與相位差之中：

其中π是一個常數（3.14159265），λ是光照射在試樣的波長。 的光程差是兩個方面的產品：厚度（t）和在折射率（n）之差。 所述OPD常常可以相當大，即使對象物的厚度是相當薄的。 另一方面，當檢體和周圍介質的折射率是相等的，所述OPD是零，即使試樣的厚度是非常大的。 在這種情況下，光通過對象行進僅僅延遲（相位差），相對于通過所述環繞的相等厚度的光。 相位差都不能檢測由人的眼睛。

在相差顯微鏡被設計為采取的檢體，并在周圍的培養基中的對象之間的相位差的優勢。 然而，它不是簡單的相位差是必要的，但也從試樣的衍射必須發生在相差顯微鏡工作。

相位物體的最常見的形狀是連續變化的光路或密度，如示于圖5。在此情況下的半球形標本1，相位物體的側面可以用數學近似通過棱鏡的形狀，如下面所討論。 相位物體的圖5中的折射率為n(s)和該周圍介質中，n(m)。 在形狀自由基幾何轉變為相位物體只發生在邊緣A和B（見圖5的（a））。 入射光撞擊物體垂直于平面AB，而平面波陣面是平行于AB。

在1的邊界（圖5中的圓形相位物體的頂點（a））的基本上平行于入射的波前，而在邊界A和 B是垂直的。區2到4是由一個相切的相位對象（圖5（b））的圓形表面所限定的微型棱鏡。 在“棱鏡”角度較小，在區域2比在區域4，它是相對的區域4'。 在邊緣A和 B的衍射是最強的。

因而，彎曲的對象是由許多棱鏡和對象的相對側都定向在相反方向的棱鏡。 最陡的棱鏡是在球形物體的赤道，而棱鏡用最少的斜率分別位于頂部和底部。 這些微型棱鏡形成光學梯度：

其中α是切線相對于所述平面波前 的角度。 注意，光學梯度是兩個方面的產品：該光通過邊之間的角度（α），并且在折射率的差（n(s) - n(m)）。 光穿過棱鏡由角Φ（見圖5（c）和圖5（d））的變化方向。 在方向上的變化可能是大的，即使在斜坡或邊界梯度可以是小的，如果在折射率的差較大。 如果折射率是相同的，所述光波通過無折射的相位物體通過。 光射出的棱鏡的方向是依賴于相位物體(n(s))和其周圍介質之間的折射率的相對差（n(m);參見圖5（c）和圖5（d））。

正如我們前面所討論的，圓形的相位物體連續變化的光學梯度，并且每個單獨的光學梯度“棱鏡”創建的光偏轉的角度不同。 圖5（c）示出了偏轉的方向，當周圍介質的折射率比相位物體更大（n(m) > n(s)），和圖5（d）示出的方向時，情況正好相反（n(m) < n(s)）。 偏轉，Φ，所述的角度是成正比的切線角度（α）和折射率差(n(s) - n(m)），使得：

對于小角度：

總結光學梯度的邊界，其中的“棱鏡”的效果時，相位物體的折射率大于周圍介質的是，該對象的每個斜坡上大小相等的梯度偏轉以相同的角度。 此偏轉角依賴于相對折射率差和幾何切線角度（α）。 當介質（n(m)）的折射率大于所述對象（n(s)）的折射率，偏轉距離時，情況正好相反的對面。 當沒有梯度，有燈的無偏轉穿過。

光可以與樣品通過各種機制進行交互以產生圖像對比度。 這些包括反射從表面，吸收，折射，偏振，熒光和衍射。 相反，也可以通過照相或數字電子技術增加了在顯微鏡的光學元件和照明模式的物理改性以及操縱最終圖像。 下面的討論突出了檢體和光之間的各種相互作用和回顧一些已開發，以提高檢體的對比光學顯微技術。

當入射的光線照射不透明表面，它被反射的方式，是專用于該表面的地形。 非常光滑的表面反射的光以一定的角度等于該入射光，被稱為鏡面反射一個機制。 不平或漫反射表面往往反映光在所有可能的角度由這種現象被稱為漫反射 ，導致光進入物鏡的量減少。 對比度在反射光顯微術可通過仔細試樣制備得到增強。 金相樣品往往蝕刻反應液體和氣體，以揭示晶粒邊界和/或拋光，以增加光量反射到顯微鏡。 漬，在熒光染料，薄膜，和金屬涂層的形式，也可用于引入在反射光顯微鏡標本的對比度。 雙折射標本可利用偏振光的反射光，透明的相位對象通常觀察使用諸如反射微分干涉對比，暗場照明，和霍夫曼調制對比技術受試者進行成像。

人眼對在檢體的振幅和波長的差異非常敏感。 出于這個原因，許多標本切成非常薄的切片（范圍從1-30微米厚），并用化學染料，以增加對比度和居住標本內的結構之間進行區分。 這種技術已經相當普遍用于生物標本數百年。 染料選擇性地從一個或幾個波長吸收光線，并通過或反射所有其他波長的光。 一個例子是藍色染料，吸收所有可見光波長除藍色，這是從反射并通過檢體發送。 的生物試樣的內部結構元件通常染色與染料以選擇性染色這些元素的混合物，增加對材料的背景下，或者是透明的或染色的不同的顏色的對比。

這些技術也適用于熒光染料，其可用于增加標本對比度具有特異性的程度高。 當熒光試樣刺激的可見光或近紫外光一個波長，它們經常發光的波長較長，從而成為可見或對比相對在現場或背景（圖6）的其他對象。 技術中的熒光顯微鏡進行了詳細的顯微鏡底漆的另一部分進行討論。

染色標本的對比度增加的早期和目前使用的方法是利用色彩對比濾光片，雷登涂漆明膠平方（自Kodak），或干涉濾光器中的光路。 例如，如果檢體染色用紅色污點，綠色過濾器會變暗紅色區域從而增加對比度。 另一方面，綠色過濾器將減輕任何綠色染區。 彩色濾光片是非常有價值的輔助工具標本的對比，尤其是當黑白顯微攝影是物鏡。 綠色過濾器用于消色差物鏡，這是球的綠燈糾正，并相差物鏡，這是專為操作波長假設使用綠色光的利用尤其重要，因為相標本通常是透明的，缺乏內在的顏色。

各向異性材料通常表現出兩個或更多的折射率，并因此被稱為雙折射，或雙重折射。 其中包括在這一類中的樣品是礦物質，晶體（其表現出的結構對稱性的高度），纖維，毛發，和其它生物標本。 當光進入一個非光學（軸比光軸除外）的各向異性晶體的軸，它被折射成兩個射線每個極化與取向成直角彼此其振動方向，并以不同的速度行進。 所得的光波被極化，并且可以干擾時，在顯微鏡分析器重新組合以產生被高度著色并含顯著量的對比雙折射標本的圖像。

活標本和其他階段的對象，這往往產生于明照明觀察較差的圖像，是由光下相差，霍夫曼調制對比度和微分干涉對比照明觀察，而不是化學意味著清晰可見。 這些技術需要在顯微鏡特殊的光學元件，但通常會產生足夠的對比度的圖像，以顯示有關標本結構的重要細節。 這些對比度增強技術的更深入的討論可以在我們可以找到專門的顯微技術部分。

另一種簡單的技術用于對比度改進涉及一安裝介質具有折射率從該檢體的顯著不同的選擇。 例如，硅藻可安裝在各種對比增強介質，諸如空氣或商用介質蘇合香的。 在折射率差提高了這些無色物體的對比度，并呈現他們的輪廓和標記更為明顯。 以下部分描述了許多用于當今的顯微鏡，以提高標本的對比更復雜的技術。

表1列出所選擇的對比度增強技術（S），適用于各種標本和材料進行了研究與兩個發射和反射光顯微鏡的摘要。 該表可被用作粗略的指導，以接近在光學顯微鏡特定成像問題。