徠卡顯微鏡動態超分辨率顯微鏡

超分辨率顯微鏡技術徹底改變了生物學，因為在過去十年。 在他們的幫助細胞組分現在可以在蛋白質的大小可視化。 然而，成像活細胞是對于大多數的超分辨率的原則是一個挑戰。 在這方面，一個名為uPAINT（通用積分累積成像納米級地形）技術抓住了關注。 此單分子方法利用連續標記，任意生物分子膜的動態成像在活細胞中以非常高的密度以顯示超分辨的圖像和單個分子的軌跡。

定位顯微鏡

例如STORM，dSTORM / GSDIM或（SPT）的PALM基于本地化超分辨率技術基于時間去相關的熒光。 通過實現分離的分子“發射，隨后將其定位與subdiffraction精度可以用來重建超分辨的圖像。 為了使這些方法來工作，視場內的分子的絕大多數必須處于非發光狀態。

為了實現熒光發射的時間分離，制定了幾種方法：

• STORM（隨機光學重建顯微鏡）方法，通過將大多數人口的進入一個黑暗的狀態，具有高功率激光照明的幫助下實現單分子的時間分辨熒光.為了使這種方法的工作樣品必須被嵌入在氧化或還原緩沖劑以穩定的熒光團的斷開狀態。 隨機的分子的一個亞群逸出從暗狀態和發出熒光。 這種“對速度”可以是微調由圍繞標本和照明與第二激光（405納米）的解決方案，它減少了在關閉狀態的壽命。

• PALM（圖片激活定位顯微鏡）技術采用光活化/敞篷熒光蛋白，可以“變身”開和關。激活后，他們進行成像，直到他們漂白。 在這種情況下，激活光源的強度決定了熒光激活率。

用定位顯微鏡技術的幫助下，一個子衍射分辨率達到和細胞組分可在前所未有的細節進行可視化。 然而存在用于這些類型的方法實現，即天然蛋白質的超分辨圖像上活細胞的一個重大挑戰。

當研究人員要求，研究內源性蛋白在高密度在活細胞中，無論是STORM 也PALM技術完美地完成所有必需的前提條件。在基于STORM的情況下，接近降低成像緩沖區與活細胞不兼容。 PALM又取決于遺傳修飾的嵌合光活化的熒光蛋白質的利用率，從而內源性蛋白不能被觀察到。

通用積累點成像的納米地形（uPAINT）是一個復雜的技術規避這些問題。它的工作原理是動態成像單分子軌道上下偏斜照明細胞表面，因此導致在超分辨的天然生物分子的行為的跟蹤，在活細胞的表面上。

相比之下，傳統的定位顯微鏡方法，其利用用于成像的分子的一小部分隨機的熒光發射，uPAINT由成像低濃度的熒光配體，因為它們結合，并與它們的靶相互作用的小光量內實現熒光信號的時間分離。

該uPAINT原則

通用PAINT追溯到原來的做法稱為漆 （點積累的成像納米拓樸圖）。用于此目的的熒光標記的探針擴散在溶液中，并開始在結合到感興趣的對象，以發出熒光。阿列克謝Sharanov和Robin Hochstrasser通過連續靶向脂質雙層和大單層囊泡與尼羅紅是不發熒光的水溶液而開始發熒光在疏水環境中引入這種方法。在水中快速分子擴散導致尼羅紅的恒定通量在膜的附近。隨后出現從它進入膜的時刻的熒光信號。在這種新的環境探測成為熒光和流動性急劇下降，使得其檢測帶攝像頭（幾毫秒），直到光漂白發生。 通過確定每個單獨的熒光信號，大約分辨率的心25（nm）是可能的。 然而，由于非常短的持續時間插入（毫秒）就不可能追蹤單個分子在長時間內的行為。（奧林巴斯顯微鏡）

后來格雷戈里Giannone和Eric Hosy重點，克服一些原漆技術的局限性。 通過使用特定的熒光配體（即抗體）代替非特異性膜染料，單，特定蛋白質相互作用的動態成像成為可能。由于更廣泛的應用帶寬，這種方法被命名為通用PAINT。

對于這種技術背景未結合標記的配體存在于培養基中的熒光，通過使用斜光 （圖1）克服。從轉移其預期使用TIRF激光是關鍵。發送激光略低于臨界角向載玻片導致了“ 高度傾斜和層壓光學片 ”（HILO）傾斜穿過試樣的形成。 本卷中只有熒光很興奮。

低濃度的標記的配體加入到介質洗澡的檢體內部的緩沖器。布朗擴散導致配體在細胞表面的連續和隨機結合到它們的目標。希洛光路內只熒光很興奮和成像（圖1）。

A）                                        B）

圖。1：uPAINT原則。 A）徠卡SR GSD 3D提供了機會，調整激光束的滲透角度。 與它的TIRF（全內反射熒光）照明可以實現，如果該激光打玻璃滑動標本相間超越所謂臨界角θ

與此相反，以用于涂料脂質探針的相對較短和插入依賴性熒光，從用于uPAINT配位體的信號通過光漂白的染料，而不是配體解離速率的主要是限制。

因此，結合的配體的運動可以被跟蹤和記錄有子衍射分辨率。隨后的數據分析和重建的配位體的運動導致所謂的軌跡，表示他們的路線。由于大量的數據可以被收集，關于配位體'的速度，分娩，簇組織等統計信息可以被提取，例如，研究膜受體在突觸（圖2）。

A）                 B）                C）             D）

圖2：在不同的步驟uPAINT成像。 A） 轉染與突觸標記荷馬-GFP神經元的落射熒光細節（勾勒的單元格）。在實驗過程中獲得的單個圖像的 B） 為例。 綁定到其目標結構以及四個孤立的單一熒光配體（ATTO 647）（未指定）。 每個粒子將是超本地化通過計算（像素大小為160nm）。C）過度積累的所有單顆粒本地化的。 亮像素對應于樹枝狀（象素尺寸20納米）。D） 的 個別蛋白質的軌跡的高度參觀的地方。 每種顏色對應一個粒子的旅程。

各種生物問題可以探討與uPAINT。 由此，各熒光探針具有仔細根據不同的用途來進行選擇。例如，以到達受限制的地區，小的探針如Tris NTA-ATTO或Fab片段可以用（約2納米以記錄長的軌跡，多耦合抗體是優選的。有趣的是，即使單個分子的FRET實驗可以開發

總之uPAINT不僅產生超分辨的圖像，但也提供了超分辨上在活細胞中的單，具體的，膜結合的生物分子的動態信息。 而相比之下，傳統的定位顯微鏡技術，uPAINT規避有害緩沖劑或遺傳修飾的蛋白的用途，并相應地使鄰近的自然條件下，觀察

所述uPAINT技術的一個限制是，它被限制為質膜結合的分子的研究。因為熒光標記的抗體，不能穿透活細胞的完整細胞質膜，這是不可能用uPAINT來研究細胞內蛋白質的動態。

uPAINT與徠卡SR GSD 3D

徠卡SR GSD 3D提供了兩種基本的操作模式：落射熒光和全內反射熒光照明。 對于TIRF（全內反射熒光）照明的照明器的TIRF準直的激光束到蓋玻璃，含有在水溶液中的檢體。 如果激光束超過臨界角，以該玻璃滑動水相間，發生全反射。在同一時間的漸逝波傳播入試樣在玻璃載片的另一側。 其刺入深度可以從80至250納米通過傾斜角度的激光被操縱。 漸逝場內部僅熒光團將被激發，產生了非常好的信噪比。 出于這個原因的TIRF照明是優選的技術觀察近質膜過程（圖1）。

通過移動激光入射低于臨界角時，它把載玻片，并隨后照射試樣傾斜。 裝置只有樣品的一小部分是由激發光照亮。 在此所謂的HILO獲取的圖像（高傾斜和層疊光學片）模式顯示出低背景和良好的信噪比。 此外漂白和光毒性可以降低用這種方法得到的在延長的細胞生存力（圖1）。

在實踐中的Leica SR GSD 3D提供了兩種不同的工作模式下工作的激光束的TIRF分別HILO照明（見圖3）。

自動模式可以選擇預定義的穿透深度逐步介于80和250納米。此外，漸逝場（方位角）的方向可以以四種不同的方式來確定。

在專家模式允許自由選擇的穿透深度的漸逝場的移動的綠色區域內的滑動件（見圖3）。超出綠區的激光超過臨界角，并開始以誘導HILO偏斜照明。

A）                       B）                        C）

圖3：自動與專家模式：穿透深度和激發激光束的方位可以由成像軟件控制。 A）自動模式使從80到250納米加上四個不同的消逝場方向選擇的穿透深度的消逝場逐步的。 B）專家模式可以設置的穿透深度無級采用了滑蓋。 綠化面積標志著TIRF區。 C）把滑塊出綠色TIRF區達到HILO照明。

對于一個uPAINT實驗中，生長在玻璃底室的細胞應覆蓋有非熒光介質（離子溶液如臺氏培養基）并置于顯微鏡。在明模式搜索細胞后可以識別并專注于觀察一個有趣的領域。隨后在顯微鏡必須被切換到GSD模式，正確的濾波器立方體和激光必須選擇。 現在，專家模式有助于找到HILO照明的正確設置（見上文）。 注意該滑塊和該激光的滲透角的依次位置取決于單元厚度。 事后熒光團偶聯的抗體或配體，必須向培養基中加入。在隨后的采集僅熒光團結合到相關抗原在細胞膜會發出熒光。 由于偏斜照明，未結合的配體將不會被激發，從而防止它們的漂白和降低噪音水平。在實驗的過程中，質膜蛋白的恒定標簽可以被成像。 原始數據文件隨后可被用于重建的本地化和單個分子中的超分辨率的動態變化。

uPAINT實驗有時需要長采集周期（幾十秒）來揭示感興趣幾乎所有蛋白質的運動和組織。在這種情況下，漂移可以通過圖像圖像檢測珠的位置（FE TetraSpeck TM）的修正。 收購完成后，徠卡SR GSD 3D軟件能夠通過珠的本土化自動重新定位每個圖像。研究納米團簇例如，當這種漂移校正模式是必不可少的。

總括而言，徠卡SR GSD 3D提供不同的照明方案。 它原來的用途是做下TIRF或落射熒光照明dSTORM / GSDIM超分辨率顯微鏡。此外，HILO照明可以進行的，必需的uPAINT。因而兩者，蛋白質靜態以及動態數據可以收集與一個顯微鏡使該組織的超分辨檢查外加蛋白質的內源性水平在活細胞的動態。