徠卡顯微鏡冷凍斷裂和腐蝕簡介
冷凍斷裂描述了技術打破了冷凍標本展示內部結構。 冷凍蝕刻表面冰的升華在真空下揭示破碎的臉,原本隱藏的細節。 金屬/碳混合使樣品在掃描電鏡成像(block-face)或TEM(復制品)。 它是用來調查例如細胞細胞器,膜層和乳劑。 生物應用技術是傳統,但開始在物理學和材料科學發展的意義。 最近,凍結骨折電子顯微鏡,特別是凍結immunolabelling復制品(FRIL),提供了新的見解的角色動態膜蛋白的細胞過程。
圖1:在小麥蚜蟲離開
適合環境的電子顯微鏡
電子顯微鏡的室轉移到一個非常低的壓力。 活細胞的結構放在這個環境不能保留由于極其快速蒸發的水使大多數細胞的一部分。
有許多生物樣品的可能性做準備。 材料可以保存(固定),隨后脫水產生最小破壞體內的結構,可以用環境掃描電鏡或水可以凍結。 高壓冷凍是唯一的方法觀察水化結構在自然狀態。 冰由高壓冷凍不是六角冰,這顯示了一個增加體積的水冰但無定形冰,體積保持不變。 因此結構敏感的滲透和溫度變化是保存(請參閱文章“ 簡要介紹高壓凍結”)。
觀察結構如細胞細胞器膜,液體乳劑或表面接口,凍結骨折是唯一的方式。 冷凍樣品壞了武力的刀(或類似)或釋放彈簧負載和阻力最小的路線。
圖2:凍結骨折
升華和凝結的水——凍結腐蝕和污染
揭示斷裂表面的細節,冰已經被刪除。 這需要通過升華冰保存標本的結構。 冰直接轉化為水蒸氣不經過液態這將導致體積和結構損傷的變化。
圖3:ES,Exoplasmic表面;PF,原生質的斷裂臉;英孚,Exoplasmatic骨折臉;PS,原生質的斷裂臉;Cyt,細胞質
水的升華/冷凝過程取決于在特定溫度和飽和壓力的有效部分水壓力室中的水或冰。 注意:一個好的真空降低了部分水壓力。
例如:冰或冷凍標本溫度為-120°C的飽和壓力約為10 7 mbar。 如果這種壓力室設立,冷凝和蒸發平衡。 蒸發的分子的數量等于凝聚分子的數量。 在更高的壓力冷凝率高于升華率-冰晶在試樣表面的生長。 這可以避免。 冷(標本)板以上標本減少了當地的壓力和工作作為一個凝結的陷阱。 水分子從標本優先附著在冷表面。 在壓力低于飽和壓力比分子升華冷凝和冷凍蝕刻。
執行凍結蝕刻,直到樣品是完全無冰的,稱為冷凍干燥。 這個過程只適用于小樣本在合理的時間執行。 完成幾個步驟通過加熱在-120°C到-60°C維持每一步的溫度在一定時間。 這可能需要幾天。
圖4:飽和蒸汽壓(1982年由Umrath)
在試樣的溫度低于-120°C蝕刻率非常低,腐蝕時間增加到不切實際的時期。 如果真空室的壓力是固定的,它可以增加腐蝕率提高試樣的溫度。 小心溫度高于-90°C的生物樣本。 蝕刻率極大增加。 此外六角冰形式從玻化冰,導致脫水文物。
純水的理論升華率降低,因為:
水的深度標本升華物低于水的表面。
溶劑鹽和大分子減少升華速度。
相當一部分的束縛水的生物樣品升華率較低。
冷凍斷裂生成圖像
冷凍斷裂和冷凍蝕刻技術需要在真空條件下沉積在裂縫表面極薄重金屬和碳薄膜。
冷凍斷裂的樣品在用金屬角后跟一個碳備份薄膜包衣（徠卡EM ACE600凍結骨折或徠卡EM BAF060與徠卡EM VCT100），以產生一個副本，以在TEM或掃描電鏡塊面進行成像。
對于這兩種方法有一定量的蝕刻時間以同樣的方式經過該斷裂面涂敷。第一薄（2-7 nm）的重金屬下角涂層產生地形對比度（陰影）。第二個90°下涂布在厚的碳層（15-20納米），以穩定的超薄金屬膜。在這一點上，蝕刻過程停止。將圖像的非常小的結構的重金屬是在非常低的角度（2-8°）的施加和涂層過程中的樣品被旋轉。這增加了對比的絲狀和小結構。這種技術被稱為低角度的旋轉陰影。
電子束蒸發應當用于重金屬膜。這是涂層技術，給人一種非常精細和定向沉積。碳的支承層穩定它們由金屬露出的結構。這些結構將改變溫度的升高而在其輪廓，樣本不會是完全導電的，副本也不會粘在一起。
單向凍結破碎酵母的陰影
圖5:左:低溫掃描電鏡,BSE(背散射電子)的形象。 右:復制品,TEM圖像(由Electronmicroscopy蘇黎世理工學院)
應用程序
圖6:高通濾波器,徠卡EM VCT100轉移到徠卡EM BAF060冷凍蝕刻和低溫涂料使用電子束***和旋轉試樣架。 徠卡EM VCT100轉移到低溫掃描電鏡。 托公式在油/水基地,大約。 3分鐘-100°C(升華)暴露脂質層(粗糙紋理晶片+乳化劑)。 由斯蒂芬·維斯納博士,拜爾斯道夫,漢堡
圖7:高通濾波器,徠卡EM VCT100轉移為冷凍斷裂/冷凍蝕刻和徠卡EM BAF060 cryo-coating使用電子束***和旋轉試樣架。 EM VCT100轉移到低溫掃描電鏡。 有翼的硅藻混合文化的原生生物游仆蟲屬。 羅蘭博士的斑點,NIBSC陶工酒吧,英國
圖8:高通濾波器,凍結破碎、冷凍蝕刻和低溫caoted徠卡EM BAF060 /萊卡EM VCT100過戶到低溫掃描電鏡。 油/水乳化暴露骨折洋蔥狀薄片形成液滴的成分。 由斯蒂芬·維斯納博士,拜爾斯道夫,漢堡
圖9:酵母細胞在TEM復制品。 高壓冷凍黃金標本在徠卡EM BAF060運營商和冷凍斷裂。 由Elektronenmikroskopie蘇黎世理工學院
圖10:Funghus大麥葉片。 安裝在徠卡EM BAF060標本表通過冷卻和冷凍標本表在液態氮。 徠卡EM BAF060部分冷凍乾(冷凍干燥標本溫度較高)。 與鎢涂層。 徠卡EM VCT100轉移到低溫FESEM 5凱文。