徠卡顯微鏡深層組織成像清除步驟
為什么結算? 好奇心是人類的天性。 并沒有什么吸引盡可能多的好奇心的生物體。 雖然在古代那些減少人體對做研究開放被處死,教皇克萊門特七世和現代解剖學開始后才允許解剖,我們現在可以看大腦工作生活的動物——有良好的機會很快就能夠干擾治療的觀察活動(或控制)的目的。
圖1:調查的深層結構躺在哺乳動物大腦沒有機械切片,一個新穎的方法使用電泳組織清算,以減少光散射。 Non-sectioned Thy1-YFP小鼠腦組織清晰成像處理與新徠卡HC FLUOTAR L 25 x / 1.00 IMM motCORR VISIR目標共焦系統由徠卡微系統。 由卡爾Deisserroth Raju。托馬,斯坦福大學,帕洛阿爾托,美國CA)。
插入顯示海馬的三維多色圖像。 EYFP(綠色),parvalbumin-positive神經元(紅色),和GFAP(藍色)。 許可麥克米倫出版社有限公司:自然497:332 - 37歲,2013年版權。
中世紀禁止打開人體——至少在小說——繞過了超人的特殊能力:x射線視力。 雖然已經有一些科學討論這個話題,很明顯,沒有辦法通過不透明材料的可見光。 觀察組織生活的材料,如通過顱窗大腦,不允許我們內心深處,散射和吸收仍然發生在大腦組織。 作為一個選項固定材料,各種協議的“清算”提出了在顯微鏡的歷史。 這些協議旨在減少散射和消除吸收物質。
結算方法
經典的“電鍍”在微觀化學準備協議,如氫氧化鉀和乳酸,化學修改的組織。 尤其是chitin-containing對象受益于這樣的待遇。 丁香油也被用來制造組織透明,很容易與加拿大香油和混相類似的折射率(1.54)。 除了漂白吸收分子,在成像厚生物對象的主要問題是散射,這發生在許多的邊界改變折射率(圖2 b和c)的光去旅游。 因此,結算方法的主要任務是“平衡”折射率不破壞的三維結構和沒有退化,可能現在的熒光染料。
圖2:通過吸收顏料)低透明度;b)低透明度將有效散射表面折射率變化;c)高透明度均衡后的折射率。
一個選擇減少折射率變化組織是刪除水和取代它的有機化合物有更高的折射率。 只要100年前,Spalteholz描述這樣一種治療苯甲醇和水楊酸甲酯。 他建議,最后安裝解決方案必須有相同的折射率的平均指數干的材料。 許多衍生過程一直以來發表,主要不同化學品應用(包括丁香油)。 所有這些協議有兩個常見的步驟:首先“干”的示例通過孵化與增加濃度的乙醇或四氫呋喃等,然后用高指數補充溶劑甘油、苯甲酸芐alcohol-benzyl(巴伯)或二芐基醚(DBE)。 磷酸后是不可能這樣的處理和結算之前必須應用。 熒光染料不太穩定,成像后應盡快進行清理。 對于大多數食譜,樣例在治療通常會收縮,這表明三維結構一致性可能部分丟失。
類似的方法試圖增加水的折射率階段通過添加水溶性化合物,如葡萄糖,果糖(SeeDB)或尿素(規模)。 在這種情況下,樣品不需要干燥。 體積的變化依賴于方法,可以低(SeeDB)或大(規模)。 由于高滲透性,材料可能擴大1.5倍,沿著一個軸。 的擴張可能是一個重大貢獻更高的透明度。 為了看遠方進入組織,擴大樣本是適得其反,自由工作距離物鏡的成像深度的限制。 如果一個樣本擴大1.6倍,有效最大成像深度降低38%。
三分之一的方式減少折射率變化來取代水極性溶劑(n = 1.33)的高折射率,ClearT使用孵化與甲酰胺(n = 1.45)。 這個過程不會改變音量太明顯,讓親脂性的示蹤染料成像,由于協議不使用洗滌劑,破壞膜結構。 變體添加聚乙二醇,保護綠色熒光蛋白從解體和因此產生更好的信號與熒光蛋白樣品標簽。
Pellucidation過程
在他的書中，Spalteholz使用的術語“DAS Durchsichtigmachen” - 一個陌生的詞，即使是德國人。這是比“清算”更具體，因為它的字面意思是“pellucidation”，即“做透明” - 當然，不破壞空間結構。為了實現這一目標，通過一種完全不同的方法，該集團卡爾戴瑟羅特的著手開發新的程序，真正使大腦透明不破壞蛋白質的組裝，并采用串行immunostainings調查的網狀組織功能的分子排列的選項。他們稱他們的方法，凈度。
正如上面提到的，鬧事的深成像是脂質。大腦的membranome為蘇摩膜，軸突和樹突狀管，核信封，房室膜和突觸結構的復雜和密集堆積礫巖。非常有效的散射體 - - 移動大約在所有細胞上的頂端，這個集合是由囊泡數量龐大的加冕。所有這些膜的工作是為了保持結構的完整性，并分離各隔室中。只需添加清潔劑會溶解膜結構和轉換的大腦了接近原始湯。
因此，在凈度協議（圖3）的第一個步驟是一個過程，銷的蛋白到其三維坐標 - 不依賴于膜結構。為此目的，一個整體（麻醉）動物被灌注的單體，用于生產水凝膠，經典的丙烯酰胺和交聯劑（甲醛）。甲醛將共價結合到蛋白質和其它生物分子，這是它的經典功能作為固定劑。它也將交聯的水凝膠的單體的生物分子，但不是脂質。該解決方案還包含一個熱引發劑。經過徹底灌注在低溫下，將溫度升高到37℃。加入的熱引發劑開始聚合反應，生成的水凝膠 - 就像任何酰胺凝膠。大部分蛋白質成為三維網狀，這是因此稱為混合凝膠的一部分。這是怎樣的蛋白質被固定到其在體內的位置。
圖3:a)與膜生物組織(厚的黑色線條)支持蛋白質的空間分布(彩色)。 b)與聚合物組件灌注后,水凝膠的蛋白質固定(薄藍線)與交聯(藍點)。 c)膜切除后,組織是透明的,甚至滲透大分子,如抗體和熒光染料。 他們體內的蛋白質和其他生物分子固定坐標。
在第二步中,大腦是孵化與SDS的解決方案。 洗滌劑溶解膜和形成膠團。 水凝膠,包括生物分子——不受影響。 加快這個清算過程,除去微粒加速了電泳,因此這個過程被稱為電泳組織清算(等)-脂質是大腦的電吸出。 剩下的結構是一個membrane-free水凝膠包含大部分的蛋白質在原來的位置。 水凝膠的光學性質完全改變:高度透明(軟性隱形眼鏡是由水凝膠)和折射率是相對均勻的整個大腦。 因此,散射是接近于零,組織是透明的。
整個過程是非常友好的熒光蛋白。 如果動物包含一個或一系列的熒光蛋白,清除組織將呈現這些蛋白質在原來的位置,和熒光是不滅的。(這是一個問題在巴伯準備,規模和部分協議)。 樣品不僅是透明的,但也允許大分子的擴散層深處。 串行磷酸與一組不同顏色的熒光染料可用整個大腦。 這是大腦結構映射的關鍵項目和類似的研究任務。 親脂性的示蹤染料,如DiI,當然不會使用lipid-free樣本(除非使用染料,可以交聯水凝膠)。
光學符合
圖4:新開發的HC FLUOTAR L 25 x / 1.00 IMM(n E = 1.457)motCORR VISIR目標標本處理清晰。
樣品準備好清晰的方法可能與所有熒光的熒光成像技術,最好是用共焦顯微鏡,提供所需的高軸向分辨率。 鏡片應該有一個足夠長的工作距離允許集中通過大腦沒有機械切片。 腦映射,視野應該大,為了記錄完整的大腦盡可能幾瓦的水平。 所需的空間分辨率要求高數值孔徑,和多通道多光子成像需要高性能的藍色至近紅外光譜范圍。 所有這些參數正確的關鍵甚至幾毫米的深度是一個控制的光學路徑長度,即校正領鏡頭,使其適應不同的折射率。
徠卡推出這樣一個鏡頭:HC FLUOTAR L 25 x / 1.00 IMM(n E = 1.457)motCORR VISIR。 這個鏡頭提供了22毫米的視野在25倍放大,即場近1×1毫米。 橫向分辨率是250海里的藍綠色光,和自由工作距離是6毫米。 這是足以示例12毫米厚度的對象,當了一次。 鏡頭有很高的透過率從470納米到1200納米,這是專為樣品折射率在1.45。 修正領機動和批軟件控制,這使得自動校正而聚焦在樣品不同位置。