徠卡顯微鏡STED樣品制備與快速指南
本指南的目的是作為一個快速參考指南最常見問題關于樣品的準備徠卡SP8 TCS發生的3倍,通過介紹所需的理論基礎 樣本受激發射損耗 。 它提供了最常見的信息免疫熒光標記技術 , 越來越多的媒體工作 , 基本質量優化程序 和 實驗設計 。 它還包含一個詳細的列表,試劑、抗體和一次性用品經常成功地用于超分辨率發生的顯微鏡。 總之,本指南是為了現在的必要的知識,包括一些提示和技巧,為用戶準備他們的第一個超分辨率顯微鏡樣品。
指導的重點設置 Leica TCS SP8 STED 3X 與592 and 660nm STED激光
受激發射損耗（STED）顯微鏡是基于熒光共焦成像，其中圖像是通過掃描形成聚焦光點在感興趣的區域，并且通過像素收集的熒光順序像素獲得的超分辨率方法。該技術的主要優勢有：
橫向分辨率沒有任何額外的后處理低于50 nm渦流環室
內在的共焦光學切片，用渦甜甜圈時，使收購約500納米的平面，三維結構，甚至幾十微米深層組織內的
使用z軸分辨率低于130 nm甜甜圈
到水平和分辨率提高空間分布于感興趣的樣品/應用單獨匹配的能力
每秒幾個圖像的快速圖像采集
通過使用熒光蛋白或其他熒光標記活的成像能力
能夠選擇的熒光在很寬的光譜范圍由幾個不同的激光器受激發射損耗在一臺儀器啟用
步驟1:選擇樣本
受激發射損耗可以在一個大的各種樣品的應用，從單一培養的扁平細胞，組織切片，以整體動物，如線蟲（線蟲）和昆蟲（果蠅）。盡管如此幾點應該加以考慮。受激發射損耗應用專門開發的受激發射損耗100X /1.4油浸物鏡，其中有90微米的工作距離。因此，所觀察到的結構應該是至多80微米遠離護罩玻璃，但優選在20μm的范圍內以獲得最佳性能。另外，為了達到最佳的效果，在安裝介質的折射率應當與所使用的浸沒的索引（浸漬液=1.518，也見步驟5）。目前在我們的投資組合干浸的物鏡。
該結構必須是光學上可訪問的。自發熒光，折射率的突然和不可預測的變化（如含有空氣，髓鞘和脂肪組織）可影響焦斑的形狀和顯微鏡的結果的性能。如果與結算解決方案的經驗是可用的，它可能是值得的測試。
在STED成像，樣品在592納米或660納米的波長照射強光。這是該試樣沒有在這些波長處吸收光至關重要。
步驟2:選擇熒光團
有一個廣泛的徠卡STED顯微鏡表現良好的熒光基團（如見附錄A）。為了達到幾個小時，在這一個系統示范正常范圍內實現了令人滿意的結果，最好是留在熒光徠卡提出的保留節目。如果這是不可能的，熒光團應選擇，它們具有相似的激發和發射光譜的建議染料。這也有利于入手單色染色和，一旦這些被批準，轉移到多色實驗。請參閱附錄B和C的推薦熒光體組合多色實驗，它不需要額外的光譜分離。對于受激發射損耗，以提高工作效率，無論是熒光的發射光譜需要顯示的受激發射損耗波長顯著發射（見例之星440SX和俄勒岡綠488在下面的圖）。
為了使染料和類似的排放不同激發的光譜分離是必需的。為受激發射損耗與592納米，這是通過使用大的斯托克斯位移染料（BD V500，STAR440SX，STAR470SX）與位于更遠的頻譜的左邊吸收光譜，比常規染料的吸收光譜常常實現。
它主要是能夠包括額外的染料為更多的顏色。門控受激發射損耗技術使染料與可敬的決議（顯著低于80納米）的受激發射損耗相同波長的顯著不太嚴格的選擇。這最終使得與592線受激發射損耗（如星440SX，俄勒岡綠488和Alexa Fluor532）三色標記成像。門控受激發射損耗三色成像三個標準染料與660激光受激發射損耗（如Alexa的488，將Alexa Fluor532和TMR）的實現。
STED顯微鏡提供了最可靠的超分辨共定位數據。受激發射損耗甜甜圈/行確定的熒光可以被去除，因此該通道可以被視為本質上一致。當然，人們也可以依次用幾個STED行工作，以達到最佳的可能的解決方案對于給定的熒光團，但對于完美的共定位數據，這可能需要修正，因為它們是為其他的超分辨率技術必需為好。
另外其他的熒光標記物可被用作counterstainings用共聚焦分辨率。這些染料的發射，然而，應該駐留的受激發射損耗檢測的范圍，能夠以其他方式與STED圖像質量干擾之外。此外，它很可能是這些染料將吸收強STED消耗光并得到漂白。因此，所有的參照圖像應受激發射損耗圖像之前被收購。
注意，使用DAPI和Hoechst公司可能對圖像質量（背景）有負面影響，特別是與592毫微米STED耗盡激光。
步驟3:選擇主要抗體/標簽的結構
為了分析給定樣品中的受激發射損耗的性能，該試驗被最佳地劃分成兩部分。 A部分和B可能并行執行，其中A為對照實驗二
A) 在根據環境評價的STED性能
熒光染料和抗體是明智的周圍環境（pH值，鹽濃度，氧化還原試劑）。為了從給定的樣品檢查染料的性能，在第一步驟中，一個完善的初級抗體，應選擇，給出了一個具體的，明亮的染色。即使沒有實際的生物相關性，此步驟有助于確保將染料按預期在周圍環境中。
B）與所述感興趣結構工作
在第二步驟中，在技術上更為苛刻染色可以成像，現在針對所感興趣的實際結構。
標記密度起著超分辨率重要的作用，但它不能被正確地與常規的顯微鏡檢查。通常，在染色過程中，增加抗體濃度已有助于提高樣品質量。因此，建議具有較高的抗體濃度（2?5倍）的受激發射損耗成像合作，以確保最佳標記密度。
明智的做法是測試不同的小學和中學染料濃度在步驟A和B染色的質量（亮度/背景），應檢查并有可能使用之前STED成像傳統的顯微鏡進行了優化。
步驟4:例如抗體染色
警告 | 有害物質 |
| 預防措施來保護你，其他人與環境 |
在抗體染色程序執行的每個動作對樣品的質量有顯著影響。每個步驟將細胞培養用標準免疫熒光協議的方式來簡單地說明，作為一個例子中的最優化步驟為他/她自己的協議，以幫助用戶：
試劑
?磷酸鹽緩沖鹽水（PBS），pH值7.4
? 在PBS中的2％多聚甲醛（PFA）
? 1％ Triton的PBS
? 牛血清白蛋白（BSA）
過程
所有的步驟都是在室溫下進行,評論是在括號中。
沖洗3次，用PBS
（細胞應洗滌，培養基由幾次漂洗培養除去。組織應解剖并從部件可能妨礙圖像采集洗凈，用建立的實驗室協議，如果它們是已知的工作。樣品必須輕輕地和快速地處理，這本來會導致過早死亡和分解。）在PBS中進行15分鐘固定與2％ PFA
（樣品固定在樣品制備中的關鍵步驟，因為它定義了如何很好的結構將被保留。隨著分辨率這個步驟變得更加重要，應小心處理。PFA是一種常見的固色劑，但它并不總是表現最佳之一。這里可能需要一些研究在文獻和優化。替代地，溫育5分鐘，用冰冷的（-20℃）100％甲醇中可以使用的甲醇固定不需要額外的通透性的步驟，因此，步驟5和6可以用甲醇固定被忽略，也參見下文）。沖洗3次，用PBS
(刪除更高濃度的固定液為以下步驟)。與PBS洗滌3次進行5分鐘
(刪除其余的固定液以下步驟)。在PBS 10分鐘通透與0.1％的Triton
（關鍵步驟以顯示表位的第一抗體。較低濃度/短的孵育時間可更好地保持了結構，但妥協標記密度，較高的濃度/較長的孵育時間可能使表位更容易獲得的抗體，但也惡化的結構。某些固定劑（如甲醇），不需要額外的通透步驟。）與PBS沖洗3倍
（去除滲透劑。）在PBS中的2％BSA的1小時
（阻斷可以用不同的試劑來進行，通常由結合于非特異性結合伴侶，否則將結合的抗體與增加的熒光染料的非特異性標記的惰性蛋白質，也是最好用封端劑而與抗體孵育作為血清有助于保持細胞結構，較厚的組織，可能需要較長的培養時間。）孵化與第一抗體進行1小時
（用較高的抗體濃度可能是受激發射損耗試驗很有幫助，潛伏期較長時間經常給出更好的結果，但要注意可能增加的背景下，在較厚的樣品（如全坐騎）潛伏期可能長達幾天，或者潛伏期可以做到在4℃下過夜）。與PBS洗滌3次進行5分鐘
（洗滌步驟是重要的，使用高濃度的抗體，尤其是當5分鐘為單位的絕對最小的洗滌步驟，在這里，否則轉移到10或20分鐘的孵育和更多次獲得更好的結果上漂洗步驟可能加快該過程。）孵化與二次抗體進行1小時
（您可能需要采用/優化抗體濃度為您的應用孵化與二次抗體應該進行類似的一抗孵育二抗一個良好的起點是1稀釋：100，從商業來源的時候買的，否則，5×比推薦的稀釋更高對于貝克頓迪金森和V500染色使用生物素化的抗體從杰克遜免疫研究實驗室以1稀釋度：100在這個步驟中溫育，也可以一蹴而就較厚的組織需要較長的培養時間）。與PBS洗滌3次進行5分鐘
(刪除 從樣本的抗體。 更長、更洗步驟將提高質量和特異性的熒光標簽。 以前的清洗步驟可能加速這一過程。)額外的步驟只需要與BD V500染色時:
?孵化與Streptavidin-V500 30分鐘
(額外的步驟當BD V500用于熒光標記。 稀釋的V500應該1:50。 可能需要更長時間孵化項目心臟組織。)
?清洗與PBS 3 x 5分鐘
(刪除釋放Streptavidin-V500從樣本。 更長、更洗步驟將提高質量和特異性的熒光標簽。 以前的清洗步驟可能加快進程。)安裝
(見下面的步驟5)存儲在4°C
最后,染色應該清晰和明亮,當通過目鏡觀察時(如592年發生的:GFP設置單一的顏色,或CFP / YFP設置雙顏色與標準和大斯托克斯位移染料)和產量好信號噪聲在共聚焦或寬視場熒光顯微鏡。
第五步:安裝
該安裝介質應具有的折射率匹配，以使最高穿透深度沒有令人不快的畸變所要求的目標的浸漬。此外，沒有自發熒光應與592納米或660納米的激光照射時，可以觀察到，也不應含有DAPI或Hoechst公司（為592毫微米STED）。或者，如果DNA /細胞核染色要求，PicoGreen（Invitrogen）中被發現與兩個592納米和660納米STED表現良好。
在某些情況下，安裝的介質影響的大的斯托克斯位移染料的熒光量子產率（例如的Vectashield），或熒光蛋白和一些綠色染料（如TDE - 染料在TDE工作請參閱施陶特等人的列表，2007）。因此，我們不與大Stoke's移染料推薦的Vectashield的利用起來。延長黃金（Invitrogen公司）也表現良好在我們的手中，并建議由徠卡。
非常良好的結果也與相當簡單的自制甘油基于安裝獲得如下所述：
甘油
通過結合不同數量的水(PBS)和甘油(甚至只是純甘油)折射率(RI)可以精確調整在1.33和1.47之間。 此外,它很容易準備,適合長樣本存儲在-20°C。Mowiol
6克的甘油(分析純),加入2.4克Mowiol粉(Calbiochem # 475904),6毫升水的桌子,12毫升0.2三羥甲基氨基甲烷緩沖液的pH值8和攪拌大約4小時的解決方案。 隨后讓解決方案其他額外的2小時。 孵化Mowiol 10分鐘50°C(水浴)和離心機的解決方案在5000克15分鐘。 最后,把上層的凍結存儲介質在-20°C。 Mowiol是迄今為止最適合介質發生的圖像,可用于-20°C存儲的樣本。
所有徠卡物鏡與蓋玻片校正修正為1.5 #蓋玻片(優:0.170±0.01毫米厚,Hecht-Assistent,貓。 1014/2424),數量應該用于安裝和大大提高圖像質量而發生的# 1蓋玻片不僅也為共焦成像。
常見的不變色,例如DABCO(2.5%)或核計劃組(4%),也可能導致重大改變所使用的染料和有時photo-physical屬性發生的。
第六步:實時成像
徠卡TCS SP8 STED3X模塊目前僅支持倒置顯微鏡代表和現場成像程序，必須做相應的調整。良好的結果已經報告了一系列熒光蛋白。
熒光蛋白 | 激發(nm) | 損耗(nm) |
|---|---|---|
mTurquoise2 | 434 | 592 |
eGFP | 484 | 592 |
EmGFP (Emerald) | 487 | 592 |
mNeonGreen | 506 | 592 |
eYFP | 514 | 592/660 |
Venus | 515 | 592/660 |
mCitrine | 516 | 592/660 |
dsRed | 558 | 660 |
mStrawberry | 574 | 660 |
但是，用于標記活體細胞（如微管蛋白跟蹤綠，俄勒岡綠BABTA）也有機染料是有說服力的。
如果實時成像實驗需要的話，最好是直接從徠卡人員以澄清的實驗步驟，并且如果必要的設備出現在現場。
附錄A:合物進行染色的名單
熒光團 | 激發 (nm) | 消耗 (nm) | 提供者 | Cat. number |
|---|---|---|---|---|
Biotinylated Antibody | – | – | Jackson Immunoresearch | 115-065-003 (老鼠) |
BD Horizon V500** | 458/470 | 592 | Beckton & Dickinson | 561419 (Streptavidin) |
Abberior STAR 440SX** | 458/470 | 592 | Abberior | 2-0002-003-7 (老鼠) |
ATTO 488 | 488 | 592 | Sigma-Aldrich | 62197 (老鼠) |
Abberior STAR 488* | 488 | 592 | Abberior | 2-0002-006-8 (老鼠) |
Alexa Fluor 488* | 488 | 592 | life technologies | A11001 (老鼠) |
Chromeo 488* | 488 | 592 | Active Motif | 15051 (老鼠) |
FITC | 488 | 592 | Sigma-Aldrich | F0257 (老鼠) |
DyLight 488* | 488 | 592 | Thermo Scientific | 35502 (老鼠) |
Chromeo 505** | 488/514 | 592 | Active Motif | 15050 (老鼠) |
Oregon Green 488** | 488/514 | 592 | life technologies | 06380 (老鼠) |
Abberior STAR 470SX** | 470 | 660 | Abberior | 2-0002-004-4 (老鼠) |
Alexa Fluor 514**+ | 514 | 592/660 | life technologies | A31555 (老鼠) |
Alexa Fluor 532**+ | 532 | 592/660 | life technologies | A11002 (老鼠) |
Alexa Fluor 546** | 546 | 660 | life technologies | A11030 (老鼠) |
Cy3** | 550 | 660 | life technologies | A10521 (老鼠) |
Tetramethylrhodamine/TRITC** | 554 | 660 | life technologies | A16071 (老鼠) |
Alexa Fluor 555** | 555 | 660 | life technologies | A21424 (老鼠) |
CF 555* | 550 | 660 | Biotium Inc. | 20031 (老鼠) |
Alexa Fluor 568**+ | 568 | 660 | life technologies | A11004 (老鼠) |
Alexa Fluor 594**+ | 594 | 660 | life technologies | A11032 (老鼠) |
附錄A：報道與徠卡STED顯微鏡工作的一些結合物的清單。
* 推薦染料單色實驗;
* *推薦染料單、雙和三色實驗。
+ 可能需要先進的成像參數設置，由于較高的抗中風的激勵，如小針孔，受激發射損耗低激光功率和高門啟動值。
附錄B:推薦雙顏色染料組合單發生的激光線*
STED: 592nm ,660nm | |||||
染料1 | 染料2 | ||||
名字 | 激發 | 發射:例如 | 的名字 | 激發 | 發射:例如 |
BD Horizon V500 | 485/470 | 475 - 510 | Oregon Green 488/Chromeo 505 | 514/520 | 523 - 580 |
Abberior STAR 440SX | 458/470 | 475 - 515 | Oregon Green 488/Chromeo 505 | 514/520 | 523 - 580 |
Alexa Fluor 532 | 514年 | 520 - 565 | TMR/TRITC/Alexa Fluor 568 | 580 | 590 - 650 |
Chromeo 505 | 505年 | 515 - 565 | TMR/TRITC/Alexa Fluor 568 | 580 | 590 - 650 |
*染料的光譜可能轉向，由于環境條件，結合型和樣品的年齡。我可能需要最佳光譜分離的激勵線和檢測范圍略有調整。原則上，建議的染料進行了測試，發現沒有或通道之間只有很小的交叉談判。
附錄C：推薦三色染料組合，單個和多個受激發射損耗的激光線*
STED: 592nm ,660nm | ||||||||
染料1 | 染料2 | 染料3 | ||||||
名字 | 激發 | 發射 | 名字 | 激發 | 發射 | 名字 | 激發 | 發射 |
STAR 440 SX** | 470 | 475 - 505 | Oregon Green 488 | 510 | 515 - 530 | Alexa Fluor 532 | 540 | 550 - 585 |
Oregon Green 488** | 470 | 475 - 525 | Alexa Fluor 532 | 532 | 538 - 550 | TMR/TRITC | 580 | 590 - 650 |
Alexa Fluor 514** | 480 | 490 - 535 | Alexa Fluor 546 | 540 | 545 - 580 | Alexa Fluor 594 | 590 | 600 - 650 |
* 染料的光譜可能轉向，由于環境條件，結合型和樣品的年齡。我可能需要最佳光譜分離的激勵線和檢測范圍略有調整。原則上，建議的染料進行了測試，發現沒有或通道之間只有很小的交叉談判。
* *多色圖像可以通過使用嵌合STED只有激光或兩者STED激光器幀獲取/依次堆疊