流通（通常被稱為交叉或串擾）的熒光發射，由于很寬的帶寬和非對稱譜形的許多常見的熒光團的表現，是一個根本的問題，必須解決兩個寬視場和激光掃描共聚焦熒光顯微鏡。這種現象通常表現為一個熒光團在光電倍增管通道或通過濾波器組合保留第二熒光檢測的發射。流通通過工件通常的解釋復雜的實驗結果，特別是如果熒光團的亞細胞共定位是調查或定量測量是必要的，如在共振能量轉移（煩惱的）和光漂白（FRAP）的案例。
成像的標本有兩個或兩個以上的熒光標簽（或植物組織切片表現出高度的自發熒光）常并發流通或交叉的熒光發射，除非這兩個熒光基團的光譜分布是非常良好的分離。例如，當雙標記與傳統的綠色和紅色的探針，熒光素和羅丹明流通通過，只能通過使用濾波器組的優化熒光減少（和/或光電倍增管檢測器狹縫寬度），但是不能完全消除。這種效果是由于這樣的事實，這些染料有很寬的吸收和發射光譜表現出相當程度的重疊。因此，利用氬離子激光488納米的熒光激發光譜線會產生激發羅丹明，雖然在較小的程度。此外，熒光發射將被檢測的光電倍增管通道或域濾波器組保留羅丹明。
光譜泄放通過在小鼠小腸和Cy3標記的Alexa Fluor 488個薄片（花青染料），和成像激光掃描共聚焦顯微鏡具有可調節的光電倍增管縫，如圖1所示。這些熒光表現出的吸收和發射光譜相似的熒光素和羅丹明，雖然略有不同的峰值波長和稍微窄的帶寬。圖片說明的數字1對（一）和1（b）得到了同時橫向掃描標本采用氬離子激光（488納米；圖1（a））和一個綠色的氦氖激光（543納米；圖1（b））。注意的Alexa Fluor 488熒光滲漏明顯在Cy3檢測通道（圖1（b）），這表現在最終的融合圖像的重疊區域的黃色（圖1（c））。這件神器可以很容易地與熒光共定位的困惑。通過依次掃描標本用單個激光器和熒光檢測每個通道與激光照明（圖1（d）和1（E）；在下面更詳細地討論），光譜泄放通過最小化（比較圖1（c）圖1（f））產生一個更準確的合并圖像的熒光分布。
Alexa Fluor 488檢測通道（見圖1（a）和1（d））的光電倍增管的狹縫被設置為30納米的帶寬（從500到530納米），包括原發性探針的發射峰，但不捕獲的Cy3熒光發射大量。作為一個結果，的Alexa Fluor 488通道不在正常的電壓增益設置檢測Cy3熒光發射，無論是儀器掃描同時或順序。相反，從菁染料捕獲足夠的熒光發射，Cy3標記檢測通道光電倍增管縫必須設置為一個更廣泛的范圍內（555至625納米），這也允許的Alexa Fluor 488發射的波長較長，在檢測器寄存器。因此，調整檢測器狹縫（或干擾濾波器）不足以充分減少流通有高程度的重疊熒光光譜。在許多情況下，流通可以通過明智的選擇的熒光團的吸收和發射光譜具有很好的分離。用Alexa Fluor 568（Cy3在這個實例中的發光峰值波長35納米的差異）會導致與氦氖激光激發效率稍低，但能顯著降低流通。
一個比較的光譜重疊的一系列的Alexa Fluor染料組合的雙色標記實驗可能有用，如圖2所示。所有的發射光譜進行歸一化處理，比較，和重疊的區域是由灰色陰影表示。圖2（a），為綠色熒光的Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 555橙黃色熒光發射光譜表明峰值波長分離清楚，也容易被人眼識別。然而，頻譜重疊的中等水平（灰色陰影區）表明，有相當數量的排放的Alexa Fluor 488在Alexa Fluor 555的峰值發射波長（由一個黑色的線運行，從發射峰橫坐標表示）。這種高水平的信號流通使探針的困難在哪兒的Alexa Fluor 488的熒光發射強度顯著高于Alexa Fluor 555的情況下分離，可由于一些因素，包括標簽的目標人群發生大的差異。這些探頭是由488納米和543納米的光譜線的氬離子和綠色的氦氖激光器有效激發，分別。
Alexa Fluor探針下降之間的光譜重疊的發射最大值的增加之間的帶寬，如圖2所示（B）。在這種情況下，的Alexa Fluor 488和橙色熒光的Alexa Fluor 594展示了一個減少重疊的水平相比，圖2（一）。兩種染料是很容易區分，對人的眼睛和光譜重疊程度低，應以最小的好成績排在雙標記實驗，提供每個探針的濃度的樣品是相似的。Alexa Fluor 594是最有效的一個氪氬激光或黃色的氦氖激光器的594納米線的568納米線的興奮。或許在可見光發光的Alexa Fluor染料的最佳光譜分離的Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 633描繪在圖2（c）的比較。幾乎沒有任何的光譜重疊之間的這些染料和流通通過工件應該是不存在的，即使在含有過量的Alexa Fluor 488例。Alexa Fluor 633探針是由紅色的氦氖激光或氪氬激光647納米線的633納米的光譜線的有效激勵。
在描述的光譜重疊的工件，條款流通，交叉，和串擾經常互換。雖然流通和交叉引用的熒光發射的溢出（或興奮）從一個濾波器組或光電倍增管檢測通道到另一個，串擾是廣泛應用于過濾行業描述最低衰減水平放置兩濾波器串聯在一起的。一個固定的濾波器組合的串擾值為制造商匹配時，熒光激發，發射是非常重要的，和一套雙色分光鏡的過濾器，但有點不同于光譜泄放通過共聚焦顯微鏡。因此，應小心使用選擇項從一個檢測器通道到另一個描述的熒光發射的重疊，和研究者應該認識到不同的術語。
光譜交叉可以激發和合成的熒光和熒光蛋白質通常利用共聚焦顯微鏡發射過程中發生的。在一般情況下，熒光吸收之間的交叉（或興奮）光譜譜線發生向藍端（短波長）的頻譜，而熒光發射光譜之間的交叉發生在紅（長波長）區。例如，從一個綠色的熒光發射的紅光發射濾波器通常可以通過檢測，但紅色染料是只有很少的成像通過綠色發射濾波器。這是由于這樣的事實，和發射光譜的染料不均勻的吸收，但通常顯示長，傾斜的尾部，覆蓋地區的幾十到幾百納米的。吸收光譜一般都傾向于較短的波長，而偏向于較長波長的發射光譜。為此，多色熒光成像應與紅了（長波長峰值發射）染料成像第一，使用的激發波長，只有最低限度的吸收光譜的藍染料的傾斜，尾巴。
樣品標簽的預防措施，減少流通
確定的物理和空間位置，以及生物分子和感興趣的亞細胞結構之間的關聯，標記標本與兩個或兩個以上的探針在熒光顯微鏡是一種非常有效的技術。在這方面，激光共聚焦顯微鏡（當使用兩個或兩個以上的激光器）非常適合于多標記技術由于區分個別熒光團的熒光發射光譜之間通過引導信號檢測能力的幾個途徑。有，然而，眾多的限制，必須在執行多個標記實驗認為，無論是傳統的廣角熒光顯微鏡和激光共聚焦或。
常用的熒光團的熒光發射光譜有明顯不同的關于帶寬，峰值發射波長，對稱性，和數量的最大值。在多標記的標本，如果標簽和從熒光團的熒光發射強度不均衡度，明亮的信號可以壓倒和滲透屏障濾光通道保留較弱的熒光團或那些不太豐富的物鏡。結果往往是從overstained熒光記錄保留一個低強度的探索頻道形象的重大貢獻。從探針如熒光素和羅丹明熒光強度（以及他們的親屬）應該是相似的，根據試樣中的染料量和照明光源的調整。例如，在相同濃度下，羅丹明興奮比在廣角熒光眼底更有效（由一個因子10）由于在汞電弧光譜明亮的546納米的發射線。
熒光發射不小心被過分強調在試樣的制備。在成像過程中，表觀平衡可以通過改變增益，光電倍增管電壓調整，或在激光共聚焦顯微鏡或通過廣角熒光燈中電弧放電的中性密度過濾器使用單獨的檢測通道的激光功率。然而，簡單的平衡與目標數量的熒光量和顏色在試樣制備將減輕許多問題時，成像和，在一般情況下，導致較高的圖像。這個概念是在圖3中用熒光素和羅丹明雙標簽的情況說明（僅給出的熒光發射光譜）。每個檢測通道窗口列出了一個彩色的盒子在圖3中，用熒光通道采集信號490和555納米之間（紅色框）和羅丹明通道設置范圍為570到665毫微米（藍箱）。請注意，羅丹明信道具有顯著更廣泛的為了從傾斜的長波長的尾部區域的發射光譜采集信號帶寬。
如果熒光團濃度是平衡的，這兩個熒光基團產生類似的發射強度，再流通量從一個通道到另一個顯示為灰色區域重疊的標記1和2圖3。顯然，一個顯著較高的熒光發射水平跨入羅丹明通道比反之亦然。程度的流通可以減少，在這種情況下，通過降低熒光素的濃度保持恒定，羅丹明。在這種情況下，熒光素標記的水平大大超過了羅丹明，流通量及通過越來越嚴重的地區，由標記重疊的增加說明3和4（注意，熒光素的濃度增加一倍，三倍，分別）。在最高的熒光素濃度圖3所示，通過排放量（面積流通4）在羅丹明渠道收集了幾乎等于該目標的熒光發射本身。
當選擇多標記樣品的熒光探針，最聰明和最耐光熒光基團應保留最豐富的靶細胞。一般來說，綠色和紅色的熒光染料往往要比那些在藍光和遠紅光的部分頻譜。然而，即使當探針濃度對量子產率，光，照明源和目標數量，嚴格控制，信號的電平交叉和流通通常是10和百分之15之間除非發射光譜最大值由100至150納米以上的分離。此外，局部環境的熒光團的吸收和發射光譜分布有顯著的影響，所以光譜的熒光基團在溶液中分離的廠商發表會顯著不同于實際的實驗條件下觀察到的。在涉及兩個或兩個以上的熒光實驗，應始終使用過濾器設置保證水平的流通通過其他熒光染色標本的檢查單是最小的控制。在許多情況下，主要的原因是不流通通過染色的熒光基團，可通過改變染色協議而不是調整曝光時間在顯微鏡下或在收購后處理圖像的校正進行廣泛的康復。
對熒光團的發射分離的儀器方法
傳統的熒光素和羅丹明熒光團，連同他們的Alexa Fluor和菁染料的親戚，是在廣角和共聚焦熒光顯微鏡的雙標記流行組合。事實上，熒光素和羅丹明探針已廣泛使用，大多數顯微鏡和售后過濾器的廠家有專門的過濾集命名后，他們的反應異硫氰酸酯中間體（異硫氰酸熒光素和TRITC，分別）。寬視場顯微鏡配備了電弧放電激發這些熒光燈一般使用495和546納米的光譜峰從汞的燃燒器，而現代的共聚焦顯微鏡采用氬離子激光488納米的光譜線和綠色的氦氖激光器的543納米線。
熒光素和羅丹明的熒光基團結合，然而，往往產生小于激光共聚焦顯微鏡，只配備一個氬或氪氬激光優化結果，既不發射波長適當的譜線（在530和560納米）對羅丹明類熒光團的最有效的激勵。相反，吸收峰在較長的波長的熒光團居住，如Alexa Fluor 568，Alexa Fluor 594，或德克薩斯紅（578，590，和596納米的吸收峰，分別）應采用氪氬激光。在某些情況下，配備了多線氬離子激光顯微鏡是用來激發熒光和與488和514納米線的羅丹明衍生物。然而，只有熒光素及其衍生物在488納米的有效激發，最具有高度傾斜發射的尾巴，表現出明顯的重疊與羅丹明類探針的發射光譜。此外，在514納米，熒光素和羅丹明（及其家屬）幾乎是同樣的興奮，導致大量的頻譜流通。
選擇兩個或兩個以上的熒光基團的單波長激光同時激發嚴重限制了實驗參數。熒光光譜必須允許同時激發顯著重疊，但大多數組合，一個熒光會被激發到一個更高的程度上比其他人。此外，發射光譜應該從每個熒光團是精心選擇的帶通濾波器，有效地分離的信號的最小為重疊度。此外，在最短的熒光激發波長的發射光譜不重疊的熒光團的吸收光譜來避免能量轉移效應。由于這些嚴格的要求，以及合適的熒光普遍缺乏，多數研究者選擇兩個或兩個以上的激光共聚焦顯微鏡多標記實驗。
兩個寬視場和激光共聚焦顯微鏡使用了鍍膜玻璃或多個薄膜干涉層熒光發射信號分離過濾器。在這些儀器中，一個雙色分光鏡把光分成兩個途徑，一個反映到樣品和其他傳送到探測器。一個帶通屏障或發射濾波器由分束器發送提煉之前由探測器收集的光，一個電荷耦合器件（CCD）或光電倍增管。雙色鏡和屏障過濾器執行的功能的限制的激發光到達檢測器和從一個單一的熒光收集最多發射信號不允許從其他的熒光排放污染的信號。因此，熒光發射的分離是高度依賴于濾波器的特性。良好的間距和/或過寬的發射光譜譜線，可以利用寬通帶發射濾波器覆蓋一百納米或更大，并產生明亮的圖像，由于熒光信號通過濾波器的高水平。這些高信號電平可以通過中性密度過濾器在廣角熒光共聚焦顯微鏡或通過降低激光功率控制。相反，緊密重疊發射光譜需要最佳的分離很窄的帶通濾波器，但在較低的信號電平的成本。
使用濾波器組檢測的熒光發射是通過過濾收集所有的光子都以同樣的方式處理的主要缺點，無論源。通過一個典型的濾波器組的傳輸不必要的波長一般在光子穿過總數的百分之10。為了解決這個難題，共焦制造商正在開發多光譜這是能夠區分基于單個熒光光譜，熒光發射源儀器（一種技術，通常稱為發射指紋）。這些先進的儀器的設計，這將可能成為現代共焦顯微鏡的中心，利用一個或更多的幾種可供選擇的區分排放在實驗中，它是不可能的或可行的選擇，非重疊的熒光探針。在多光譜成像的最簡單的方法是解剖的熒光發射波長為用細內襯色散光柵和極限集使用可移動的狹縫的特定區域。第二種方法使用一個棱鏡和聲光偏轉器代替色散光柵具有相同的功能，而三分之一的夫婦的色散光柵設計的多通道光電倍增管收集一系列窄波段（10納米）。多光譜顯微結構各有其優點和局限性，但所有三個能夠波長歧視的分辨率只有幾納米。
多光譜激光共聚焦顯微鏡的方法是選擇當成像的多個熒光蛋白變體在一個單一的實驗或自然發生的和固定的誘導熒光（通常統稱為自體熒光物鏡的熒光信號）的面具。不必要的發射信號的自體熒光和其他形式往往跨越多個頻道，一個復雜的定量分析的因素。此外，當四個或更多的熒光基團被使用在一個單一的實驗，光譜重疊的一個顯著的程度，并導致流通通過工件，是不可避免的。在這種情況下，多光譜成像是消除流通的最有前途的技術之一。多光譜成像的缺點之一是減少信號伴隨通常需要的熒光發射分離狹窄的檢測窗口。消除流通的新興工具的方法（稱為熒光壽命成像顯微鏡，或攝影）是基于門控熒光壽命研究的輸出相似的光譜譜線，熒光可以區分由于各自的衰減特性。
雖然多光譜成像是一種很有前途的處理光譜泄放通過新的方法，所需的儀器是目前非常昂貴。激光共聚焦顯微鏡配備聲光可調諧濾波器（的案例）或類似的快速激光線開關裝置可以有效地利用順序掃描標本，使用一種稱為高速頻道切換或技術multitracking。這種方法使單個熒光基團以減少或消除流通通過發射順序激發和收集，但并不能解決問題時，吸收和發射光譜重疊廣泛。在實踐中，激光線的快速切換，無論是單獨或整個框架，連接到每個通道作為其目標的熒光激發序列檢測（見圖4）。例如圖4所示，用Alexa Fluor 488和Cy3，488納米的氬離子激光線采用激發Alexa Fluor 488是打開激光掃描在年線X方向的同時，收集的Alexa Fluor 488發射使用設置為適當的濾波器的信道檢測器。在返回路徑，488納米線的關閉和樣品中的Cy3熒光探針與543納米氦氖激光線激發，又只收集熒光發射使用的Cy3兼容濾波器組的第二信道檢測器。這避免激發熒光掃描序列都同時是一個可控制流通最有效的方法，尤其是當發射濾波器的選擇是有限的。
順序掃描幀的每個通道熒光信號的并行采集是一個產生固定的標本，固定化很好的圖像很好的方法。然而，當采集圖像已被標記有兩個或兩個以上的熒光活細胞，甚至一個小的運動程度的亞細胞結構會妥協的圖像和減少共定位精度的研究。因此，對活細胞的調查更謹慎的使用快速多軌線掃描快速單個激光線之間的開關，每個信道在一個時間框架是被記錄在案的線圖像信息采集。激光共聚焦顯微鏡配備了AOTF激光控制器可交替線速度媲美或超過時所獲得的掃描兩個或三個通道同時對舊儀器掃描圖像采集。
通過熒光蛋白在流通
熒光蛋白，其發射波長從藍色到紅色現在廣泛使用，是非常有效的用于活細胞成像研究使用激光共聚焦顯微鏡，盡管有一些權衡。例如，數據采集的速度降低時，兩種以上受雇在一個實驗中，每個熒光蛋白通常需要完全不同的圖像采集條件。解決頻譜流通往往是更復雜的比傳統熒光蛋白合成探針，特別是因為前者的發射光譜往往是相當廣泛的。此外，由于不同的熒光蛋白的相對亮度的變化，每一種顏色都可能需要不同的信號積分時間。增強型青色和藍色的品種（生物和環抱式接骨板）很暗淡相比，綠色和黃色熒光蛋白，需要更長的采集時間，飽和明亮的熒光團。因此，當使用熒光蛋白，實驗要求必須與熒光的選擇來確定，以及分離的光譜特征是相似的發射強度的組合。
一個優雅的例子，通過使用熒光共焦成像的流通與高度重疊的光譜管理是增強型綠色熒光蛋白（同時檢測EGFP）和增強型黃色熒光蛋白（EYFP）在活細胞。在這種情況下，黃色熒光蛋白的圖像的收集應首先使用的氬離子激光514納米的光譜線，其中只有輕微的激發的綠色熒光蛋白（見圖5）。最佳的檢測，光電倍增管檢測器縫應該設置一個延伸的窄帶寬的地區只有20納米（530納米到550納米；圖5（b））或類似的帶通濾波器可以采用屏障。然而，該發射濾波器帶寬的精確的大小并不重要，因為只有黃色熒光蛋白是興奮。
在第二順序掃描，氬離子激光器的477納米線是用于圖像的綠色熒光蛋白在一個很窄的帶通（10納米490-500毫微米；圖5）發射濾波器的帶寬或縫。由于發射收集此實例中的關鍵，它是更容易執行成像序列，利用狹縫排除EYFP流通通過信號強度的費用。請注意，雖然488納米氬離子激光譜線更接近的增強型綠色熒光蛋白激發最大，它太靠近發射濾波器（或狹縫）帶通區域以排除激光反射光會使圖像采集。
目前，最明亮的熒光蛋白綠色和黃色，但這些物種之間的歧視，往往是成功的事實，它們的光譜峰的只有25納米分離的阻礙。正如上面所討論的，雙重或多色實驗用綠色和黃色熒光的組合是可能的，但流通之間通過濾波器組和/或從根本上減少帶寬檢測狹縫的必要性，提出了一個重大的問題。更常見的是，黃色熒光蛋白耦合雙色成像實驗的青色熒光蛋白。雖然青色熒光蛋白不比藍色的物種更明亮，它已經能夠與458納米的氬離子激光線常用的共聚焦顯微鏡上激發的兩大優勢，而且更耐漂白比藍色熒光蛋白。
組合的紅色熒光蛋白綠色或黃色熒光蛋白也能產生足夠的光譜分離，但生物制品，如緩慢的成熟和團聚體的形成，往往復雜的研究與紅色熒光蛋白的種類。第二代紅色熒光蛋白質應解決生物問題產生的多標記實驗的優秀的候選人。新熒光蛋白質的排放概況延伸到遠紅光和近紅外的地平線上。這些熒光團應該能夠利用紅氦氖633納米的光譜線，目前在很多高端的共焦系統。
量子點
量子點，這是涂有親水性聚合物殼半導體納米晶和共軛的抗體或其它生物活性基團，有沒有最傳統的熒光團的共享。不同于典型的有機熒光染料或熒光蛋白，它顯示了高度定義的頻譜分布，量子點的吸收光譜，增加穩步減少波長。相反，熒光發射強度限制在一個最大波長依賴于點的大小對稱峰，但獨立的激發波長。作為一個結果，相同的發射中觀察到無論量子點是在300，400，500或600納米，興奮，但熒光強度急劇增加，在較短的激發波長。例如，一個典型的量子點的共軛，發出橙色區域的消光系數（605納米）是約5倍時，半導體是在400和600納米的激發。在一個典型的量子點的共軛大約是30納米半最大值寬度，和光譜剖面不朝較長的波長（具有較高的強度，扭曲的“尾巴”），與大多數有機熒光染料的情況就是這樣。窄的發射譜使幾個量子點偶聯物是一個最低水平的同時通過觀察流通。
在激光共聚焦顯微鏡，量子點激發不同程度的效率最多的普通激光系統產生的光譜線，包括氬，氦鎘，氪氬，氦氖和綠色。特別有效的令人興奮的量子點中的紫色和紫外區域的新的藍光二極管和二極管泵浦固體激光器，具有突出的譜線在442納米及以下。405納米的藍色激光二極管是一種經濟的激勵源，使用量子點由于其高的消光系數在這個波長是非常有效的。在激光共聚焦顯微鏡使用這些熒光團的另一個優點是刺激多個量子點大小的能力（和光譜的顏色）在同一試樣與一個單一的激發波長，使這些探針的多標記實驗的優秀的候選人。量子點是目前的發射最大值從525到705納米的20至40納米的增量擴展，和一個近紅外探頭的發射峰在800納米。通過仔細選擇合適的量子點的組合（例如，525，585，和655；見圖6），共聚焦實驗可以與一個單一的激光和顯著減少流通的工件時，相比傳統的熒光團進行了。
通過校正流通
由于數量的熒光信號在多標記實驗可以輕易地超過了檢測系統的分辨能力，無論儀器的復雜程度，收購后的圖像處理是經常流通通過校正的唯一選擇。一系列的控制樣品應準備在進行多個標記為兩個或兩個以上的熒光減少因流通通過工件實驗結果的混亂。最重要的是控制無二次抗體或合成的熒光團（的標本制備背景控制）和標簽的標本分別（每個熒光團的流通控制）。后臺控制應獨立地研究每個激光和檢測通道的信號增益和偏移，應采用最終成像序列的極限。所有的通道將被用于圖像的多標記試樣必須經過一個獨立的背景校正，因為每個通道的熒光水平也有很大的差別。一般來說，熒光比較短的激發波長，如那些所發出的紫外線，405納米和488納米二極管，氬離子激光器。綠色，黃色，橙色和紅色激光通道，是不容易受到熒光工件。
流通的控制是必要的確定信號增益量可能在每個通道沒有引發流通到相鄰信道。例如，當檢查雙標記的熒光素和羅丹明標本，標本含有熒光素和羅丹明就應該準備。建立水平控制流通，熒光成像與氬離子激光488納米的最佳條件下，信號在羅丹明通道記錄的數量（注有標本中沒有羅丹明染料）。這個信號是通過結合背景熒光眼底流通。重復這一過程與羅丹明的控制，這一次激動人心的氦氖543納米線和檢查排到熒光通道。
這種方法通過校正需要流通的熒光強度和熒光團濃度之間的關系是不變的圖像中的所有像素。光電倍增管用于激光共聚焦顯微鏡表現出良好的線性成像時，在一個單一的波長，但在所觀察到的信號電平的大的變化可以與單個頻道由于光電倍增管的量子效率、波長的探測光之間的高度非線性關系（尤其是在響應曲線的極端）。此外，局部環境變量和光漂白在區域研究的影響必須考慮。在熒光發射光譜的波長分布的變化，雖然不太可能與最流行的探針，將影響獲得的熒光信號的檢測器之間的相對分布。
一旦有合適的控制已準備和分析，它是可能的估計信號量的流通是可能發生在試樣的熒光團對目標成像。正如上面所討論的，甚至與濾波器帶寬的優化，熒光發射的一部分將滲入羅丹明通道和一些羅丹明排放會滲入熒光素通道，雖然羅丹明流通會比觀察熒光素少得多。一些商業軟件包可以處理流通通過數據使用線性分解算法，和共聚焦顯微鏡制造商經常束類似的軟件和工具。該軟件可以應用線性聯立方程校正算法對圖像中的每個像素確定流通量的基礎上通過與試樣的強度比和控制記錄。
光譜泄放通過工件很容易混淆的共振能量轉移，共定位，和非特異性背景染色。如果一個熒光發射光譜重疊顯著的第二探針的吸收光譜，然后地區兩個熒光共定位可能發生共振能量轉移。流通可以區分進行控制測量共振能量轉移，如上所述，標本與個別熒光標記單。共振能量轉移（后可觀察到流通通過校正）的興奮與最低的最大吸收波長的熒光，然后檢測的熒光團的發射光譜與激發探測通道的信號。使用熒光素和羅丹明例，激動人心的熒光素與488納米激光后，熒光的羅丹明通道監測。任何信號記錄在羅丹明通道可能是由于共振能量轉移，但只有在地區的兩個探針共定位。
結論
總之，最好的熒光共聚焦或廣角熒光顯微鏡有最大吸收，密切配合激光和電弧放電譜線利用激發探針。選擇最豐富的目標最高的量子產率的熒光團將幫助平衡整體熒光發射。此外，窄的發射光譜探針可以大大降低問題的流通，但不會完全消除。光學濾波器組選擇研究熒光發射應緊密匹配的探針光譜對帶寬的大小和位置。同時，干擾過濾器阻塞水平往往隨制造商的不同而不同，應檢查以確保不必要的熒光發射是由過濾器排除集用于成像。
許多新合成的熒光團表現出顯著減少光漂白的敏感性，它允許較長的積分時間與CCD相機或光子采集時間降低激光功率在激光共聚焦顯微鏡。這個結果在更高質量的圖像和更少的細胞損傷過程中的活細胞成像實驗。新熒光蛋白質是比以前的版本更穩定，更可能不破壞細胞的代謝過程比合成的探針。然而，應該指出的是，所有的熒光基團會影響細胞的行為在一定程度上的潛力，特別是如果探針的化學和物理特性是由環境變量的顯著改變，如離子濃度，pH值，和疏水性的。
無論是熒光的物理特性，目標高度的特異性，以獲得合適的信號水平和減少流通通過工件是必要的，尤其是在二級抗體的免疫制劑。即使是少量的非特異性標記將產生一個高度的背景，既降低了試樣的圖像和混淆的定量解釋。許多設計突出的亞細胞結構的探針（如高爾基體和線粒體）具有特異性相對較低的水平，但仍然有用，因為已知的幾何形狀的這些細胞器。
作為制造商開發更先進的熒光團和更便宜的二極管激光系統的光譜線在可見光和近紅外區域，選擇了多標記實驗的聚焦和廣角熒光顯微鏡通過工件流通不會變得更加容易。例如，激光共聚焦顯微鏡配備了一個405納米的半導體激光，543納米的氦氖激光，和一個650納米的紅色激光二極管可以激發發射光譜的波長的最大值在100納米的熒光基團分離，從而最大限度地減少了潛在的流通。此外，在遠紅光和紅外發射光譜的熒光蛋白，將需要新激光譜線，不損害細胞的代謝過程，比目前的紫色，藍色，綠色系統。
