徠卡顯微鏡共振振鏡掃描儀智能控制
高時間分辨率顯微鏡 （HTRCLSM），需要快速掃描設備。而非共振振鏡掃描器允許充分的位置控制，但只是在速度較慢，共振掃描儀允許 ~ 25,000 行每秒，但提供更少定位自由。仍然允許縮放和平移功能，幾種方法都試過，有不同程度的成功。徠卡共聚焦顯微鏡 TCS 系列的使用是非常聰明的解決方案，使與開關時間短的無級縮放。
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"生物學是一門自然科學與生命和生物有機體的研究有關"是生物學的維基百科條目的介紹性的句子。而顯微鏡在舊天主要有關死對象 （雖然以前還活著），生物顯微鏡的最終目的是，想象生活物體。雖然小生物樣品往往看起來處于非活動狀態，微觀的角度揭示了活躍的活動。細菌有快速移動的鞭毛、 細胞和組織代謝產物顯示速度非常快的變化、 小泡運輸，非凡的速度和電氣信號播出由毫秒范圍動作電位。為了遵循這些活動，我們必須有高的幀速率。共焦顯微鏡在早期的解決方法是引入并行化技術，例如旋轉盤系統，但他們缺乏真正的共焦層析性能。單點掃描器提供最佳光學切片的性能，但通常被認為慢。采用諧振振鏡掃描器，現代技術可以達到幀速率在每秒 500 的范圍。這篇文章顯示了如何克服這些器件的限制了。
振鏡掃描器 — — 用激光光繪畫
掃描燈現貨在一個二維的地區，這束光的角度，改變。這項任務是通過偏轉束的束路徑中插入鏡子很容易解決的。要掃描，鏡像必須是可旋轉。黃金標準的旋轉鏡是采用什么叫做"振鏡掃描器"。這些設備有一直在廣泛激光投影儀的激光表演和電影放映。
"檢流計"一詞起源于電學計量。測量電流，線圈被插入到一個磁場。一根針的線圈旋轉軸上安裝。當電流通過線圈，洛侖茲力導致撓度的針。較高電流，更廣泛反對重置撓度力量。撓度可校準的測量電流。
另一方面： 如果當前已知的一個人可以創建所需的撓度。為光指向應用程序 （掃描儀），針被交換的一面鏡子。當一束光打鏡子時，反射角的改變由兩次的旋轉角度。
用于精確定位，旋轉角度解碼通過位置傳感器，安裝在旋轉桿的另一面。一個反饋系統控制的驅動電流，以保證的撓度是總是確切地在所需的角度。這允許控制的掃描速度和靜態定位中所有可用的 xy 平面上的點。這些掃描程序被稱為"閉環"已關閉的反饋制度。在成像的應用，一種重要的模式是鋸齒掃描。線掃描所需的速度是由執行移動在一個方向 （"x") 現貨線性在時間在所要求的速度。然后，若要重復掃描，鏡子被搬回最大速度的起始角度。這種模式是可能的慢線頻率作為正弦掃描的替代方法。二維掃描 — — 標準的應用程序 — — 由垂直地引入第二個掃描儀的梁路徑生成。這第二個 ("y") 掃描儀生成增量中第二個軸。顯然，y 掃描儀 （標準條件下） 的速度是 x 掃描儀相比要慢得多，因此，具有更少的限制。
在 ca.500 Hz 線頻率和 512 × 512 像素的全幀，幀速率達到約一秒。與固定的樣品，這是足夠的時間分辨率，給出了極大的信噪比。另一方面，當成像快速移動的物體，幀速率每秒 100 以上期望的 （最好是大約每秒 500）。如果這些圖像是有 10 行，每個框架 （"地帶掃描"），則需要一個掃描儀，可以生成每秒 5,000 線。
雖然掃描儀和掃描鏡輕質物料制成，都是盡可能的小，他們都是機械設備，發揮顯著的慣性。因此，更高的速度他們只能執行正弦掃描。在極端情況下，掃描儀有發達的掃描僅在正弦波模式下，只有在它們的共振頻率。像秋千，這些設備只能改變其振幅 （通過飼養更多的能量) 和他們的階段，與外部標準句號的位置。目前，與 12,000 赫茲頻率諧振振鏡掃描器是可用的。當數據記錄在兩個期間提出和背部訓練 （雙向成像），線頻率的成像可以達到 24,000，對應 ~ 45 全幀每秒，對同頻的最現代的運動圖片正在使用。在黑暗的一面，這些共振掃描儀有沒有控制的位置和掃描頻率。這種掃描儀提供電磁抽頭的反饋，但這是不太準確要的任何使用。
圖 1： 最初，靈敏電流計測量電流可以在磁場中旋轉線圈設計。左： 在流動的電流通過線圈，洛倫茲力傾斜線圈，并固定在旋轉軸的針。傾斜取決于當前，其中可以進行校準。
右： 一個更精確的版本被配備安裝于而不是針軸上一面鏡子。后照準直的光 （最好的情況： 激光燈） 到鏡子上偏轉可以監視 (飛行現貨方法) 的屏幕上。
已知的電流應用時，可以控制撓度。一程序的當前列火車將導致現場時空運動模式。這是振鏡掃描器的工作原理。
視場 — — 一個更好的選擇，比縮放因子
顯微鏡有圓形光學。當你在顯微鏡下看，你看到的是一個圓。多少您的示例，您可以觀察到在一個給定的放大是由指定字段數 FN （Sehfeldzahl，SFZ），這是直徑的毫米在目鏡 （中間圖像平面） 的外地平面中的圖像。如果使用帶有字段編號 25 40 x 鏡頭和目鏡，然后你可以觀察到的實際面積是 625 μ m 的直徑圓。當然，鏡頭有充分糾正來處理這樣一個大的領域，如果體面成像是物鏡，而通常該字段局限的共焦掃描以確保足夠的圖像質量。掃描圖像是通常正方形或矩形。如果掃描的全部字段指定 （例如上述 SFZ 25），然后矩形的對角線相等的字段編號，和一個 40 x 鏡頭會給作為對角線 625 μ m。如果掃描一個正方形，邊緣對應于 442 μ m × 442 μ m。
而不是掃描的全部領域，它是非常簡單的只是通過減少振幅 （伸長率） 的振鏡掃描器掃描它只有一小部分。如果掃描振幅是一半，只有一半各自的維度記錄。正方形的面積然后對應于四分之一的全視場掃描。
仍然，像素數是相同的和當一個監視器上顯示，顯示器的尺寸不會不改變的當然。從本質上說，更小的掃描已由兩個因素生成額外的放大倍數。這額外的放大倍數是無級可調，稱為"掃描縮放"。它不通過光學元件，并應因此不混淆與光學變焦的安排。這是不是變體中顯示記錄的像素數據，它應該不會混淆與顯示的縮放選項，要么。事實上，掃描變焦是一個機械變焦控制的掃描裝置的力學性能 （盡管這是電力驅動和控制電子和電算化）。
正對減少掃描振幅，直到它達到零沒有限制，掃描縮放可以提供無限的放大倍數。不過： 像與目鏡的放大倍數在普通顯微鏡下，有定義當掃描縮放跨越地平線上的有意義的使用規則。這些規則取決于分辨率及放大倍數的鏡頭，并記錄每個維度的像素的數目。成像，20 倍以上的掃描縮放很少需要。較高的縮放因子僅用于激光操作，例如漂白或活化。
為不同的制造商使用不同的字段編號，掃描縮放的絕對值不是可比較的。另外混淆營辦商，一些使用縮放因素甚至比一個小。一個更合理的值將實際使用的字段數，只是通過計算掃描區域的對角線和乘以這由物鏡的放大倍數。與這一指標，它是甚至可能比較在不同光放大倍數 （不同物鏡） 的表現。
不掃描時全 （光學） 字段，一個人可以自由選擇字段的哪些部分進行掃描。此函數稱為"淘金"，需要在掃描偏移量的編程，即掃描程序運行不對稱。這只是可供閉環掃描儀。共振掃描儀需要不同的解決方案為平移。
圖 2： 頂部： 光學的視野充分利用由方形掃描，觸及中間圖像字段的限制。大小對應于正方形的對角線 (與直徑的圓形領域 （虛線圓圈） 通常表明作為字段編號 FN.通常情況下，最大掃描的區域是略低光場數相同，因此我們將調用它 FN0要與之比較放大掃描。
中東： 如果掃描振幅降低，例如由因子為 3 這兩個維度，然后使用的領域也是原場直徑的 1/3。光學分辨率仍維持不變，掃描分辨率增加，這是有效放大。此操作類似于對原始領域 （1 x 放大） 3 倍變焦。為適當的比較，這應顯示的 FN，這里 FN = FN0/ 3。
底部： 縮放的掃描啟動時的中點，掃描的區域可以移動內光場。這稱為泛函數 （平移）。
如何糾正虛假的移動
正如前面提到的在掃描時的速率限制元素是 x 振鏡。如果沒有空閑的時間，所需的追述，和掃描儀可以操作在一個完美的鋸齒波，則每個像素的時間將是 1/f * x，與正在掃描頻率 f 和 x 的像素數。為真正的掃描儀，這是沒有完全達到，回縮的時間是有限的以及機械的延伸，"物鏡"被削掉，正如他們所顯示的非線性。更高的速度，可編程掃描儀操作在正弦波模式下，也可能是最慢的速度，當然。共振掃描儀只能掃描正弦規律變化。
如果掃描正弦，然后空間-時間的關系不再是線性的。作為圖像扭曲是不可以接受，強度有等距的記錄 x 和 y，對應于 inequidistant 記錄的時間。因此，數據記錄 （像素） 在一條線的開始時間是線的密度掃描儀快的線中間并且在，兩端相距越來越遠，掃描速度為零在結束和開始朝著相反的方向前進。不是完全適當的但可能解決這個問題將使用只有正中為正弦波，近似呈線性。但是然后一會失去 90%的可用的掃描時間，（雖然激光是的所有的時間），將需要在更大的振幅，反過來會減慢振鏡掃描器掃描。因此，一個使用一個較大的分數，例如 80%的一列火車 （這在雙向模式中操作時，給出了一個時間周期的 60%） 和適用的非線形的像素時鐘。這個非線性像素時鐘容易獲得閉環掃描儀，因為它們提供了使用位置解碼供外部使用。非線性像素時代的第二個作用是每個像素的錄制時間也是位置相關的事實。如果一個員工強度電流轉換為標準的電荷放大器，像素將會更明亮的邊緣。此外，噪音較少的邊緣與中心的掃描。對于正常成像，這不是一個問題。依賴噪聲的方法，如柵格圖像相關，會遭受這種記錄，由于噪聲也是短像素高和低的長像素為單位）。在這里，就必須確保不斷整合時代整個掃描區域 （這是最大的中心的短像素長度）。高頻率采樣和 intrapixel 積累,介紹了共焦顯微術 Leica TCS SP5 允許的每個像素的位置及速度的積分時間控制。
圖 3： 左： 當掃描正弦和錄音數據與統一的像素時鐘 dt，信號將會來自非等距點在樣本中，并因此會扭曲圖像。在中心，該圖像將會擴大由于掃描儀的速度更快的速度 （每時間距離： dsC).在邊緣，圖像就會受到擠壓由于掃描儀的速度慢 （每時間距離： dsE).
右： 為了獲取數據在空間上等距點 ds，像素時鐘已被編程為更長的時間的邊緣 （dtE） 和更短的時間在中心 (dtC).
一個行人的解決方案： 使用 Ronchi 光柵和砍光
A 共振掃描儀不是可編程的速度，掃描偏移和缺乏精確位置讀出。要仍雇用共振掃描儀與效益，這些缺點需要得到補償。第一個可行的解決辦法使用光學標尺中所述采樣時鐘是 1995 年由 R.Tsien 帕的共焦手冊。這種方法利用定向到作為位置探針掃描鏡的背面 （也是反射式的） 第二，低功耗的紅色激光。反射的探測光通過光柵組成的透明和非透明條紋 (Ronchi 光柵），非常像尖樁籬柵。在光柵掃描探針光和光之后由一個光電二極管檢測到。如尖樁籬柵是等距和掃描儀運動正弦波，調制光探針施加正弦脈沖長度與光明黑暗模式。這些模式的側面可以用作一個像素時鐘，然后是正弦波的時間，但在掃描的場空間等距。
雖然這一概念解決了非線性像素時鐘，它有它的局限性。像素為單位） 的最大數目被法治的網格光柵中的元素數。像素數只可能在整個數字分數在柵欄上的木條數目的切換。
可用縮放因素取決于適當的光柵： 較高的縮放因子為同等像素數字需要較短 （和密度） 光柵。因此，那里是沒有連續縮放的方式，不得不改變光柵的探針梁路徑切換時縮放，其中。因此，一套的光柵光柵在存儲庫中 — — 通常是一個可旋轉的圓盤必須可用。
平移不是用這種機械參考測量可用的。
圖 4： 左： 諧振的掃描共焦光學機械像素時鐘解碼的示意圖。用于成像、 激光針對通過分裂的鏡子上掃描鏡和激發熒光 （藍色跟蹤） 樣品中。所發出的光 （綠色跟蹤） 被 descanned 由掃描鏡，劈裂的鏡子所反映和轉換成電子信號的探測器。輔助激光定向到掃描鏡 （紅色跟蹤） 的后側 （還反映）。它通過光柵導致二進制信號像素p從檢測光電二極管。
右： 提取的一整套的像素時鐘通過追蹤探測光 （反映在背側的掃描鏡，x') 結束組成的固定數量的不透明和透明的等距條紋網格。該傳感器將產生強度信號我p其中，然后轉換成像素觸發脈沖 t像素.
一個聰明的解決方案： 使用鎖中并提取整個運動
我們如何可以設計為共振掃描儀控件允許連續縮放和任意數量的像素最多最大的選擇？與單向或雙向掃描用戶的請求嗎？在 2000 年由徠卡 TCS sp2 介紹了穩定、 精確的解決方案。這一概念以來已在系統中與共振掃描儀從徠卡。
諧振振鏡掃描器是扭諧波振蕩器。他們在簡諧運動的旋轉振蕩。因此，他們的模式是運動的一個嚴格的正弦函數。我們需要做的一切是測量的實際相位和振幅的議案中掃描儀，并激勵信號進行比較。測量是通過掃描鏡后方面上，閃耀的紅外二極管。要檢測信號，采用位置敏感器件 （PSD）。這是無定形和因此連續的測量設備，與不同的光柵，有大量預定義的元素 （限制測量的分辨率）。從那以后，我們可以通過鎖的方法，它允許我們創建一個類似于鏡子的真實運動的合成正弦函數提取的確切的振幅和相位。這是可能的因為品質因子 q 諧振振鏡是 1000 的范圍內。這意味著，系統總是激振蕩正弦規律變化的共振頻率-偏差是小于 0.1%，即使一個方波的興奮。共振頻率取決于溫度和其他環境的參數，但當我們測量頻率，我們可以肯定的運行在最佳頻率掃描儀。這種方法不是靠對精度的光柵，也不調整和更換這種光柵或其他機械的或光的艾滋病問題。通過高質量測量振幅和振蕩器的相位，我們在任何時候都有鏡子的位置非常確切的知識。
現在，在任何時刻了解現場樣品中的位置，我們可以將檢測到的信號分配給的空間坐標在 x 和 y （和 z）。我們可以自由地分解檢測強度 （其中我們連續地測量用高頻率采樣器），在任意數量的像素為單位） 的火車。那就是： 如果像素的最大數目是例如 1000 每行，我們從理論上講可以請求任何掃描格式 1 到 1000 之間。
此外，我們可以決定使用被測的信號對應于 x 掃描的邊緣處的像素時間較長。或者，要確保平等的性質來衡量高階矩像強度的方差的相關性研究，我們可以限制像素長度對整個 x 掃描一個常數。
當我們衡量和控制幅值，我們可以不斷改變字段大小。那就是： 連續縮放，這是不可能與機械格柵的引用。
如果我們想要移動縮放的區域在顯微鏡的視野中，我們可以在一個可旋轉的設備，允許一個機械的偏移量加上裝載的共振掃描儀 （在這里： 在 x 方向）。位置敏感器件和提取的屬性與鎖在系統仍工作在這些條件，允許我們使用泛函數與共振掃描下的振蕩。
圖 5： 左： 諧振的掃描共焦與鎖在像素時鐘解碼的示意圖。用于成像、 激光通過一個可編程的光聲拆分器到掃描鏡子上定向和激發熒光樣品 （藍色跟蹤） 中。所發出的光 （綠色跟蹤） 是由掃描鏡 descanned、 由器質性傳播和轉換成電子信號的探測器。一種輔助的紅外二極管被針對掃描鏡 （紅色跟蹤） 的后側 （還反映）。它到達位置敏感器件 （PSD），它提供了一個信號，表明可以重現完整的掃描鏡運動。
右： 塊圖的位置控制可調諧像素時鐘與共振掃描儀。鏡子里的運動是由位置敏感器件 （PSD） 進人鎖定放大器監察。在這里，實際運動 （act） 的幅值和相位與勵磁信號 (nom) 進行比較。基于 DSP 控制器調整任何偏離了最佳的操作，并提供正確的參數到一個像素時鐘模塊。在這里，從顯微鏡的發射信號分為空間等距段 （像素時鐘）。每個像素的實際積分時間也是可控和可覆蓋的完整像素時間 （不同樣長的邊緣與中心），或修剪世俗地等距測量到的像素積分時間。