徠卡顯微鏡從小肽的吸收建立和鑒定派生的瓣胃上皮細胞模型

材料和方法

操守準則

這項研究是根據對實驗動物福利（科技部中國科技，2006年）的國家指導方針和批準的機構動物護理和使用委員會在浙江大學進行。 在瓣胃組織是從阜陽屠宰場，杭州，中國獲得和我們獲準使用這些動物部分從這個屠宰場。

細胞培養和存儲介質

在細胞生長培養基由Dulbecco改進的Eagle培養基（DMEM，Gibco公司，美國），補充有10％（V / V）胎牛血清（FBS）（Gibco公司，美國），5μg/ ml的胰島素，10高葡萄糖制劑納克/毫升的表皮生長因子（EGF，Sigma公司，美國），100 U / ml青霉素，100微克/毫升鏈霉素，50微克/毫升慶大霉素和2.5微克/毫升兩性霉素B的新鮮制備的細胞存儲培養基由70％（體積/體積）的DMEM，20％（體積/體積）FBS和10％（體積/體積）二甲基亞砜（Sigma公司，美國）。

分離培養嗅鞘細胞和

牛瓣胃組織被新生中國荷斯坦犢牛獲得它們被宰殺后，立即，然后運到在冰冷的DMEM實驗室。串行胰蛋白酶消化進行，以嗅鞘細胞分離如前所述。 簡而言之，將組織洗滌數次，用冰冷的D-Hank氏（平衡鹽溶液）含有500單位/毫升青霉素，500微克/毫升鏈霉素，100微克/毫升慶大霉素和5微克/毫升兩性霉素B，直到溶液是干凈任何污染物。 接下來，瓣胃上皮薄層是用手術刀為約1厘米2片切碎。 碎薄片（約20g，濕重）消化在一個250ml的錐形含有100ml 2.5％胰蛋白酶（Amresco公司，美國）在D-Hank氏在搖動溫熱空氣1小時，溶液在37℃下的燒瓶浴。 接著，將消化溶液棄去，用新鮮溶液替換2或3次，以除去角質層上皮細胞。 當一團細胞具有均一的形態出現，角化細胞是不占優勢，在消化溶液收獲并用新鮮的溶液中，約每20至30分鐘，這取決于消化狀態所取代。 胰蛋白酶是細胞收獲后終止，加入冰冷的D-Hank氏含有10％FBS到消化溶液（以1:1的比例，體積/體積）。 過濾與4層的1毫米的尼龍網孔后，將收獲的溶液離心分離，在300×g離心 5分鐘，在4℃下，以從顆粒除去任何殘留的胰蛋白酶。 接著，將組織進一步消化7-8個周期。 使用血細胞計數器對細胞產量進行了評估和細胞存活率分別使用臺盼藍染色，估計。將細胞再懸浮于生長培養基中，然后接種5×10 4個細胞/ ml在塑料培養皿（康寧，美國）涂布有I型膠原（Gibco）中的密度。 培養皿在37℃和5％CO 2的加濕氣氛和生長培養基根據生長條件改為每2或3天。

以純化的上皮細胞，融合細胞分別為第一消化用10分鐘，0.15％的胰蛋白酶溶液。 當分離的成纖維細胞，并沒有變化，嗅鞘細胞進行觀察，將細胞用D-Hank氏洗滌。 接著，將剩余的細胞用0.1％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化5-10分鐘，并接種到新的培養皿中（1:2）。 對冷凍保存，將細胞以1×10 6個細胞/ ml時，分配到冷凍管的密度重新懸浮在存儲介質中，并儲存在液氮中。

用于蘇木精和伊紅染色，將組織固定在4％甲醛溶液中。 24小時后，將組織包埋在石蠟中，切成5μm的切片并用H＆E對用標準方法組織學檢查。

嗅鞘細胞的生長特性

嗅鞘細胞的體外生長方式是由細胞的倍增時間確定。 采用WST-8（博士德，中國）檢測細胞增殖情況。 簡言之，嗅鞘細胞在96孔板（康寧，美國）一式四份接種5×10 3每孔的細胞。 在特定時間點，將10μl的WST-8溶液加入到每個孔中。 接著，將細胞溫育于37℃下反應1小時，將吸光度在450nm的波長用酶標儀（Molecular Devices公司，美國）測定。 活細胞的數目是成比例的吸光度。 用相襯顯微鏡（Nikon ECLIPSE 50i的，東京，日本），將細胞的生長和形態進行了評估。

電子顯微鏡對嗅鞘細胞的超微結構

嗅鞘細胞用PBS洗滌兩次，然后固定，用2.5％戊二醛在4℃下過夜。 將細胞用PBS漂洗兩次，后綴，用1％************為2小時。 在串行乙醇稀釋脫水的細胞后，將細胞從它們的塑料支撐報廢和嵌入的Spurr樹脂。 超薄切片中依次沾上醋酸雙氧鈾和堿性檸檬酸鉛，每次15分鐘，并用透射電子顯微鏡（TEM，JEM-1230，JEOL）觀察。

首先對掃描電子顯微鏡（SEM）制成OEC蓋玻片。 根據標準程序用于TEM固定和脫水后，將試樣涂覆有金 - 鈀和使用SEM（飛利浦，XL30，荷蘭）的觀察。

免疫細胞化學染色

細胞角蛋白染色，將細胞接種于激光共聚焦培養皿（巢，中國），并洗滌3次，用D-Hank氏，用于在-20℃下10分鐘，用甲醇固定和丙酮（體積/體積），并透化，用0.25 ％PBS-的Triton 10分鐘。 然后將細胞在PBS中含5％正常山羊血清阻斷非特異性蛋白質 - 蛋白質相互作用進行孵育初級兔抗細胞角蛋白18抗體（稀釋至1:50，Abcam公司，HK）和兔抗PEPT1抗體（稀釋1:100，北京博奧森生物技術有限公司，中國）一夜之間在4°C。 隨后，將細胞溫育在次級FITC-偶聯的山羊抗兔IgG抗體（稀釋度1:100，杰克遜免疫研究實驗室公司，美國），用DAPI（Sigma公司，美國）。 將細胞在室溫下在黑暗中溫育1小時，隨后漂洗3次，用PBS進行5分鐘，并用激光共聚焦顯微鏡（Leica公司，TCS SP5，德國）顯影。

PEPT1 mRNA的嗅鞘細胞的測定

從牛瓣胃組織總RNA和嗅鞘細胞用冰冷的TRIzol（Invitrogen公司，美國）隔離。 RNA的完整性和純度通過使用NanoDrop 2000分光光度計（熱，USA）評估樣品用1％瓊脂糖凝膠電泳，并根據在λ260和λ280（> 1.8）的外徑比被確認。 合成采用逆轉錄試劑盒（Takara，日本滋賀縣）第一鏈cDNA。 （;產品長度正向：5'-TGGCTGGGGAAGTTCAAGAC-3'5'-TCCTGGCCCTCTTCAAA-3，反向'：239堿基對）用反轉錄PCR使用以下特異性引物檢測PEPT1（NM_001099378）的表達，以及甘油醛-6 -磷酸脫氫酶基因（GAPDH，AJ000039）擔任內部控制（引物：正向5'-TTGTGATGGGCGTGAACC-3'，反向5'-CCCTCCACGATGCCAAA-3';產品長度：198個基點）。 所用的PCR條件進行以下操作：在95℃下進行40個循環的5秒，34號，60℃和60秒，72℃下用30秒，在95℃初始變性和5分鐘的最后延伸72°C。 擴增的PCR產物用2％瓊脂糖凝膠，并用市售的測序公司（BGI，中國）測序。 的DNA序列進行比對來自國家生物技術信息中心數據庫中的已知PETP1序列。

攝取甘氨酸-SAR成嗅鞘細胞

glycylsarcosine的攝取（GLY-SAR，模型二肽）的嗅鞘細胞是如前所述研究 。 Hank氏平衡鹽溶液（HBSS：145 mM氯化鈉，3 mM的氯化鉀，1mM的氯化鈣 ，0.5毫摩爾MgCl 2）含有5mM D-葡萄糖和5mM HEPES（pH6.5）中被用作吸收和沖洗介質。 嗅鞘細胞鋪板在1×105個細胞/ cm 2在24孔板中的密度。 匯合（約3天）后，將細胞保持7天，以分化。 接著，用電子顯微鏡，這表明細胞已分化形成的微絨毛，橋粒和緊密連接下觀察細胞。 在同一天，OEC單層細胞漂洗兩次，預培養用HBSS 30分鐘，在37℃下 攝取加入1 ml的培養液在不同pH下（5.0，5.5，6.5，7.5），并為特定時間段（2，5，10，15，30分鐘）啟動。 研究了濃度的甘氨酸基-Sar攝取依賴，細胞與不同甘氨酸-SAR的濃度（0.5，1.0，1.5，2.5，5.0毫摩爾），在37℃或4℃。 用于抑制研究中，將細胞在37℃孵育不同的蛋氨酸 - 甘氨酸（甲硫氨酸 - 甘氨酸）的濃度（0，0.5，2.5，5.0毫摩爾）在一式四份 所有孵育均在37℃進行15分鐘，在用2.5mM的甘氨酸基-Sar pH為6.5，除非另有說明。 在孵育結束時，甘氨酸基-Sar溶液吸出，并將細胞快速洗滌四次，用冰冷的漂洗培養基（pH6.5）中。

以確定甘氨酸基-Sar的攝取量，裂解細胞用0.3毫升1％的Triton X-100溶液。 細胞裂解產物中的一部分離心12000×g的10分鐘，并使用利用高效液相色譜法（HPLC，安捷倫，1100，美國），如下所述進行量化甘氨酸基-Sar。 裂解液的另一部分被用于使用BCA蛋白測定試劑盒（凱基生物科技，南京，中國）蛋白質測定。 GLY-SAR的攝取換算為nmol /毫克protein/15分鐘。

HPLC條件：流動相：緩沖液A（0.1％三氟乙酸的水）和B（0.1％三氟乙酸的乙腈溶液）的混合物。 梯度洗脫，運行在10分鐘內，從10％緩沖液B為原料，以50％緩沖液B，以1.0毫升/分鐘的流速。 采用Kromasil 100-5C 18（4.6毫米×250毫米;阿克蘇諾貝爾公司，瑞典）用作分析柱。 將樣品的等分試樣（10微升）注入HPLC系統和甘氨酸基-Sar是在220nm處進行檢測。

統計分析

經方差分析和鄧肯的使用SAS軟件（SAS研究所，2000年）復極差測驗進行統計分析。 該數據被表示為平均值±標準誤差。 的標準意義成立為P <0.05。