徠卡顯微鏡惠更斯STED反卷積快速指南
本文檔的目的是給徠卡STED用戶簡要介紹了使用與Leica TCS STED SP8 3倍顯微鏡獲得的圖像惠更斯專業解卷積圖像。
圖1（從左至右）：共焦; 受激發射損耗; 受激發射損耗反褶積
參數編輯器（在圖像的縮略圖右鍵點擊）
圖2：概述惠更斯圖像參數編輯器。 這個窗口可以訪問所需的受激發射損耗解卷積圖像的所有相關圖像參數。 導入時，LIF文件，大部分參數都自動從元數據提取（見惠更斯Pro用戶指南從SVI更多信息）。
采樣間隔（XYZT）：從圖片屬性獲得的值
顯微鏡類型：值從圖片屬性取
數值孔徑：數值從圖片屬性取
客觀質量：取默認值“好”
蓋玻片位置：使用專用工具（圖示左側）
拍攝方向：對于DMI顯微鏡總是“向上”
針孔間距：不相干的共焦/ STED顯微鏡
鏡片浸泡：用“油”
包埋劑：從下拉菜單中選擇合適的媒介。
Backproj。 從圖片屬性獲得的值： 針孔
激發波長值從圖片屬性取
發光波長值從圖片屬性取
多光子激發：值從圖片屬性取
激發填充因子：從圖片屬性獲得的值; 默認值= 2，除了TiSaph受激發射損耗（值= 1.2）
受激發射損耗耗盡型：從圖片屬性獲得的值
STED飽和系數：見下面的更多細節
受激發射損耗波長值從圖片屬性取
受激發射損耗免疫力分數：見下面的更多細節
受激發射損耗3X：請參閱下面的詳細資料
受激發射損耗飽和度的因素
飽和因素原本是指期限：
這是受激發射損耗分辨率公式的一部分：
它定義了STED PSF的全寬半高（FWHM），最后STED圖像的分辨率。 與門控受激發射損耗和TCS STED SP8 3X，經典的理解飽和因子（主要依賴于激光強度和所選擇的染料的消耗效率）的實施是由包括關于激勵和損耗激光模式（附加信息擴展脈沖或CW）和門控檢測。 在實踐中，有兩個參數影響STED的分辨率，因此惠更斯飽和系數：STED耗盡激光強度和柵極起始數值。 請記住，為了簡化和整體實用性，被用于受激發射損耗PSF在惠更斯的計算只有一個“理想”染料的I SAT值。 每默認情況下，3.3和LAS AF版本后，預測值（來自成像參數）會自動在圖像屬性中設置并轉移到惠更斯。 對。LIF的是在LAS AF的早期版本中獲得的文件，飽和度的因素需要在惠更斯手動輸入。 飽和系數的值可能需要取決于染料的受激發射損耗效率進一步調整。 保持眼睛上的圖像分辨率（線剖面測量）的情況下，需要一些額外的改變。 下面，將顯示一個陣列示出了飽和度因子與幾種計算出的PSF的FWHM值之間的關系。 它應該提供的情況下的基準的實際圖像分辨率不同于預測1。
圖3：一個數列計算的PSF匯編（操作窗口 - >理論PSF）具有不同的飽和度因子（SF）呈現增加（但不是線性的！）全寬半高（FWHM）值。 像素尺寸：15納米。
飽和因子值和現實之間顯著的差異可以在反褶積的數據進行分析：
飽和系數太高：計算PSF是比真實的PSF顯著較小。 這將導致在工件視為不與原始圖像相關聯強烈粒狀結構。 此外，噪聲可以被誤解為信號（箭頭，見下文）。 在一般情況下，過小的點擴展函數的預測將會對數據不太明顯的影響，但小斑點和紋理可被誤判為結構細節和結果在成像數據的錯誤解釋。
圖4：對圖像質量設置過高的飽和度的因素。 箭頭表示可能的工件（噪聲放大和過度造粒和結構的反差）。
飽和因數過低：圖片會出現令人費解的，幾乎不管信噪比選擇在STED反卷積向導（見下文）。 降噪可能仍然是可以接受的，但去卷積圖像將獲得更多的信息與可能的工件生成一個巨大的損失（箭頭，見下文）。
圖5：對圖像質量設置得太低飽和度的因素。 箭頭表示顯示哪些可以在原始數據清楚地識別顯子結構的喪失斑點。
受激發射損耗3X
惠更斯居然直接從。LIF文件的圖片屬性提取正確的值。 不過也有一些事情要考慮。 在主要的受激發射損耗3D滑塊調節光的進入既可以通過“旋渦”，或“3D甜甜圈”光束的路徑，這將對橫向和軸向分辨率的增加之間的比率產生影響的百分比。
因此，計算出的PSF具有相同飽和度的形狀根據三維滾動條的位置而變化。 橫向分辨率不斷減小，而軸向分辨率的增加（見例計算的PSF與在圖6 30飽和值）。
分辨率增加，無論是尺寸，最后在其各向同性分辨率達到了3D滑塊百分比之間的比率又是依賴于所選擇的染料的受激發射損耗效率。
圖6：在惠更斯編譯生成不同的PSF計算的（操作窗口 - >理論PSF）隨著3D STED值， 隨著光的兩條光路之間的再分配的軸向和橫向半高寬之比顯著變化。 像素尺寸：15納米×40納米（XY）。
確定在3D STED正確的飽和系數的最簡單的方法在于獲得一個額外的控制圖像和0％STED 3D和調整惠更斯飽和因素對測量FWHM。 相同的飽和度因子然后可以只要同一STED激光強度和柵極啟動值被使用用于所有三維STED滑塊的位置。
受激發射損耗免疫力分數
“免疫分數”的惠更斯定義是由熒光基團，它們是免疫的受激發射損耗消耗的激光，并且可以被描述為被添加到純STED PSF一個附加的共焦聚砜組分的人口給出。
圖7： 兩個受激發射損耗的PSF比較。 在左邊的“純”受激發射損耗PSF可以看出，與設置為0％的免疫力分數。 在右邊用15％的免疫餾分產生的相同的PSF。 像素尺寸為15納米。
這里，免疫分數是一個寬泛的定義，旨在覆蓋三個不同的受激發射損耗的影響：
反斯托克斯激勵與受激發射損耗損耗激光：
在某些情況下，受激發射損耗耗盡激光也可以激發染料。 這始終是依賴于染料/激光組合。 徠卡的推薦染料/激光組合通常有沒有只非常少的反斯托克斯激勵，但在某些情況下（多色實驗），可能有必要使用染料在光譜上位于更靠近STED耗盡激光。 對于去卷積的PSF足跡的額外的增加可以通過增加免疫分數來模擬。 注意，受激發射損耗消耗激光器具有不同PSF的形狀（面包圈），以有一個固定的激發激光（點），這是沒有考慮到在免疫分數的計算。短壽命成分在STED CW和門控STED：
CW受激發射損耗損耗增加熒光壽命到受激發射損耗PSF，這偏見分辨率朝發射較長的壽命一個顯著的貢獻。 短暫的熒光，而另一方面，有受激發射損耗低效率和較差的分辨率。 熒光信號總是由不同生命周期的組件，所有在最后的STED CW PSF加起來的整個范圍。 因此，短壽命熒光是“免疫”的受激發射損耗光，這會導致類似的PSF對那些出現在圖7B中。 在檢測該底座將是不太突出的多門使用。 作為一個經驗法則，STED CW使用高達10％的免疫分數，而門控STED圖像是在3％至5％的范圍內。可憐的損耗效率脈沖受激發射損耗：
在大多數情況下，脈沖受激發射損耗的解決方案為您提供了STED PSF的清潔形式。 然而，由于同步問題，本征染料光物理學和寬度STED激光脈沖，染料的人口可能不被有效地耗盡，并且每個定義免疫耗竭激光。
總體而言，免疫餾分具有只在去卷積的圖像的質量幾乎沒有影響。 在情況下，真正的受激發射損耗PSF底座是相當廣泛的（強反斯托克斯激發和STED CW）調整計算PSF的免疫力分數到適當的水平可能使較低的背景閾值水平。 另一方面較低的背景估計的增加的信息可以提取/從原始圖像增強的量。
在理論PSF免疫力分數非常低的水平會使該算法忽略了真實的PSF，這可以通過軟件作為一個真正的信號最終被誤判的基座，并會最終導致文物，像小邊強的信號放大結構圖像。
結論
匹配計算，理論PSF，以“真正的”一罐需要幾分鐘的嘗試。 但是，一旦確定，有類似的設置實驗之間的差異在PSF形狀是微乎其微的。 此外，隨著越來越多的經驗，這些調整變得隨著時間的推移更加容易。
有在惠更斯的工具，可以幫助點擴展函數的FWHM值，這是在反褶積有幫助的估計。 在“FWHM PSF估計 ”所在的“ 分析 ”一 節中給定的圖像與單一的PSF可見的自動生成的FWHM估計。 這可以用來猜測為顯微鏡的任一對非常小的熒光珠（<35納米）或者甚至在小的結構，或者在實際樣品內的熒光背景的分辨率的近似值。 這些值可以被用來調整所計算PSF的圖像參數。
一個更優雅，也更先進的解決方案是由“PSF蒸餾器向導”的“反褶積”一節中找到提供。 此處的實際的PSF被測量并轉換成一個數學模型。 用蒸餾水PSF解卷積的數據最終會得到最好的結果，因為它考慮到了系統特定的缺陷和不對稱。 滌綸短纖蒸餾器需要具有非常好的信號 - 噪聲水平的圖像正確地提取所需的信息。
解卷積精靈（圖片縮略圖右鍵點擊）
所有圖片屬性現在可以正確地設置，接下來的步驟包括使用反卷積向導的最后的圖像處理。 在此步驟中，用戶是通過一系列的步驟，這將定義卷積參數并最終執行反卷積引導。 的SVI（網站上的部分-的去卷積步驟和圖像處理工具，在惠更斯軟件的完整描述可以的“>手冊下載”中的“ 專業用戶指南”中找到www.svi.nl ）。 在這個快速指南只有最相關的步驟將包括生成高質量的圖像和避免最常見的器物。
選擇一個PSF /負載卷積模板
圖8：加載卷積模板和文件的特殊專業服務公司。
在這個步驟中，用戶被要求加載之前保存的卷積模板并導入先前計算，或蒸餾水PSF表示。 如果沒有值或引用本節被加載后，軟件會使用去卷積的圖像作為參考圖像參數（參見參數編輯器以上）自動生成計算PSF。 請注意，反褶積精靈還提供了擴展的幫助文件（參見圖8，9，10和12的黃色文本框），并直接鏈接到SVI網頁。 為了快速卷積實驗，這一步可以忽略不計。
裁剪工具
圖9：裁剪圖像，以減少數據量，提高卷積速度。
在這第二步驟中，用戶被給予機會來移除圖像的空的區域，以提供更有效和更快的去卷積處理。 “自動裁剪”選項將自動生成建議裁剪邊界，這進一步增加了易用性。
直方圖工具和背景估計
圖10：剪切明亮的信號和背景估計是反褶積至關重要的參數。
檢查圖像的直方圖和定義背景水平是至關重要的結果的質量。 在直方圖檢查軟件警告說，非常明亮的圖像包含的區域，其中像素的強度達到最大值（在8位圖像，255）的用戶。 在這些“飽和”的區域由強度分布圖中給出的結構信息丟失（削波），這將導致偽像的產生。 對于受激發射損耗數據是很難通過圖像重建恢復裁剪區域的丟失的信息，因此要避免削波是很重要的。
背景估計階段，用戶可以設置一個相對的或絕對的背景值。 如果背景被設置得太低，則軟件可能解釋更高的背景水平和噪聲的信號錯誤地放大它們。 如果背景電平設置過高，真實的信號可以被忽略和壓制，這可能導致信息丟失。
圖11：反卷積的圖像與不同背景的絕對電平設置（原始圖像，背景= 0;背景= 15;背景= 30）。 不同的背景值顯示不準確的估計的影響。 在過低的水平（0）的噪聲被解釋為信號而導致強偽影的產生，而高背景估計（30），使結構信息丟失。
自動估計值可以用兩種不同的算法來完成。“最低”搜索圖像為平坦區域具有最低的像素值，而“中/附近的對象”搜索對象，并確定在這些對象中的直接靠近的背景。 因此，“最低”的算法一般會產生較低的背景水平比“中/近對象”。 如果需要的話，還有一個選項，它允許用戶在“手動”模式設置為自定義值。
解卷積階段
圖12：設置反褶積參數。
最大迭代次數：
在惠更斯默認CMLE算法，在許多其他反卷積解決方案的理想形象的評價是做了幾個迭代。 更多的反復測試，更好的圖像將被反卷積。 在“反褶積強度”可以其特征對比度增強，并與原始圖像相比增加了分辨率。 與過高的信噪比設置組合使用過多的迭代可能導致偽影的產生。 預設的迭代次數被設置為40，用于共焦和受激發射損耗的圖像。信號噪聲比（SNR）：
信號 - 噪聲比設置控制許多次迭代之后可達到的最大分辨率，因此，有對對象的清晰度的影響。
圖13：反卷積的圖像用不同的信號 - 噪聲電平設置（原始圖像，SNR = 2; SNR = 12，SNR = 40）。 SNR值對對象的銳度的效果。 以低水平（2）的結構似乎比在原始圖像稍大。 具有高SNR值（40）中的對象變得過分尖銳。 在這里，沒有結構消失數值越高，不像在圖 11。
找到正確的SNR值有時是困難的。 標準值的10和15之間受激發射損耗范圍內，但最好是檢查這些值真正適合。為此，線輪廓可以在整個圖像被創建（點擊并拖動圖像上），以便估計在不同強度和本底水平。 對于信噪比估計，建議使用類似的背景值在背景估計步驟中輸入的那些。 默認信噪比被設置為7，用于STED圖像和20，用于共焦圖象。
質量閾值：
測量迭代之間的品質指標之差，并作為一個停止條件。 如果質量指數顯示迭代之間沒有顯著的變化，去卷積過程停止。 這個值可以被使用，以避免不必要的重復。 默認設置為0.05迭代模式：
明智的做法是保持這個在“ 優化”。 欲了解更多詳情，請參閱本SVI用戶指南。磚布局：
明智的做法是保持這個在“自動 ”。 欲了解更多詳情，請參閱本SVI用戶指南。
整理步驟
圖14：經過去卷積過程完成，該軟件提供給檢查去卷積的圖像，然后重新啟動過程，如果需要的可能性。
在這些最后的步驟中，用戶有機會檢查所處理的圖像，并將其與原來的比較。 如果有必要，去卷積過程可以重新開始使用不同的參數和所有的圖片可終于出口回到“縮略圖一覽”窗口。
結論
現在，參與這一過程的參數的含義已被闡明，你會發現它更容易設置正確的值。 不過，也有一些基本的規則，這將確保可能的最佳結果：
運行反褶積向導之前，請務必檢查在圖像屬性中的顯微鏡參數。
如果可能的話，產生的PSF（ 操作窗口 ）和形狀的圖像小的結構比較和匹配相應的飽和度因子和免疫部分。
如果可能的話，更喜歡小棧（至少3片），以單個幀。 三維數據產生顯著更好的去卷積圖像比2D數據。
總是去卷積圖像與原始數據進行比較，以便在過程中，以排除可能的假象。 注意的是，如果結構中去卷積圖像不會出現在原始數據，或者如果對象是小到單個像素。