尼康顯微鏡拉姆達堆積和光譜特征

 類似的概念來使用的激光掃描共聚焦或解卷 積顯微術高數值孔徑物鏡較厚的標本中獲得的光學部分 （ 或 z棧）中，lambda堆棧的三維數據集，它由使用相同的試樣場的圖像采集在不同的波長帶，每一個橫跨有限的光譜區域范圍從2到20納米的獲取。 相反，在各種形式的光學顯微鏡的典型成像方案涉及在檢測器的整個波長響應頻帶獲取單個圖像（或一個連續組中的延時實驗圖像）。 本教程探討一個lambda棧的頻譜分量。 

本教程初始化與包含從沾滿EGFP的Alexa Fluor 488和SYTOX綠色出現在光譜窗口原子核捕獲一個lambda堆棧中的各個光譜范圍。 下方的光譜是單核的偽彩色圖像，因為它出現的每個10納米的波長頻帶中，具有發光強度是成正比的熒光基團的存在量。 混合光譜的圖像呈現在本教程的右下角的角落。 為了操作的教程，使用LAMBDA堆棧段滑塊通過各個波段翻譯，觀察混合后的圖像，以及在光譜圖中顯示的強度比例。 一種新的熒光團（青色，綠色或橙色）可以與光譜輪廓下拉菜單中進行選擇。

為了測量吸收染料，熒光基團，或者與多個標簽完成試樣的光譜，透射或發射的光被*分散成它的組成部分的波長和強度的各波長的波長或很窄的頻帶進行測量。 光譜分辨率是依賴于每次測量的帶寬，并增加作為采樣通道decreses的帶寬。 多種不同的技術可用于分散光，并且其中大多數已被施加的（至少在原型儀器）于顯微鏡的情況。 其中當測量光譜分辨率，波長范圍和動態范圍要考慮的*重要的特征。 光譜分辨率是由可以彼此區分開來，并且是高度精確的光譜成像測量的關鍵參數*接近的波長來確定。 光譜范圍是指波長的總數（實際上，帶寬）在一個特定的測量。 *后，檢測限和動態范圍定義必要的信號的*低水平進行測量和區分的等級數在一個特定的測量，分別。 所有這些值可以改變每個熒光團或吸光物質的光譜曲線的函數。

圖1所示是一個典型的組中的6納米跨越500至692納米的波長范圍內，以產生含有32幅圖像的lambda棧（在下面詳細討論）的順序獲得的帶寬光譜圖像。 該標本是貼壁人宮頸癌細胞（HeLa細胞系）細胞中的DNA和RNA用吖啶橙染色及成像與尼康A1光譜共焦顯微鏡系統的文化。 圖像（512×512像素）采用32通道多陽極光電倍增管以每秒24幀采用488納米激光激發的記錄。 如此高的采集速度，這是顯著益處在活細胞成像，通過*的信號處理技術，加上快速模擬 - 數字轉換電路，其操作以配合光電倍增管成為可能。