尼康顯微鏡完美的機械對焦偏移系統

 關鍵概念尼康PFS相關的是精確地檢測一個合適的軸向可用于建立試樣中的物鏡前透鏡元件的位置和感興趣的焦平面之間的精確關系近端（z）的參考平面。 這個任務是使用近紅外光（870毫微米），它由一個輔助光學系統產生并引入通過一個二色鏡的主要光學顯微鏡列車實現。在870納米的光，不與正常的透射光或熒光觀察干涉，被聚焦的物鏡項物鏡線性圖案在折射率邊界駐留在玻璃蓋玻片（折射率1.5）和周圍介質之間的標本（共,1.33-1 .38折射率）使用油浸物鏡時。 水的折射率邊界作為當水或油浸物鏡所采用的參考平面，但干物鏡使用空氣 - 玻璃邊界在面向物鏡前透鏡元件的蓋玻片的另一側。 本教程將探討偏移鏡頭系統，使尼康的PFS的操作。

教程初始化與尼康PFS的示意圖偏移透鏡系統和線路的CCD出現在沿與顯微鏡焦平面在試樣窗的視圖的主窗口。 為了操作的教程，使用偏移控制滑塊來改變PFS 偏移量 ，從而改變了參考平面和焦平面之間的距離。 作為該滑塊被翻譯，在試樣焦點區域也被改變，這種作用是通過改變線狀圖案廣播到CCD中的教程窗口的上部示出。 盡管在光學系統沿水平軸的教程所示，它實際上是垂直的，在實際的顯微鏡。 需要注意的是真實的PSF單元響應以毫秒為單位集中漂移，因此本教程中的動作放緩的教學考試的物鏡。

油站單元的一個關鍵部件是偏置調整透鏡系統，其位于該半透半反鏡和主二色鏡之間，并與圖1的示意圖概述。由于其定位，偏移透鏡系統是由共享兩個LED的照明狹縫和線的CCD成象的PFS的光學列車。 偏移系統用于與控制顯微鏡軸向（z）的位置的電子反饋回路轉移加油站狹縫圖像的焦點位置在和諧，從而使系統能夠對試樣和玻璃-水界面創建完全獨立的焦平面。 檢體圖像平面被定向到檢測器或目鏡和狹縫圖像是通過兩個獨立的光學系統引導到PFS線CCD探測器。

在圖1（a）所示，只含有偏移透鏡和主顯微鏡物鏡，以及檢體和蓋玻片光學系列的簡化版本，提出了為使說明簡潔。 另外，插圖呈現為其中參考平面所在在蓋玻片上的下表面的空氣 - 玻璃界面的干燥物鏡的情況。 黃色光線追跡是指在圖像形成主鏡光學系統的光波。 黃色光線不透過光的PFS列車通過由于上述限制二色鏡，其引導這些圖象形成的波前的目鏡或其他檢測器。 紅色射線追蹤生成并由PFS單元收集輪廓焦點檢測光波。 偏移透鏡組件被稱為轉塔透鏡和圖1中的偏移透鏡 ，這些透鏡移位PFS生成的狹縫圖像，它被投射到蓋玻片界面，來回沿著光軸，他們也同時移反射圖象向上或跨線CCD的檢測器的像素下來。 偏移的系統的物鏡是使操作者選擇的標本與物鏡的焦平面重合的區域，同時維持物鏡前透鏡元件和試樣之間的固定距離蓋玻片使用PFS漂移校正硬件。

偏移系統炮塔透鏡被固定在光軸上（摻入多透鏡轉塔），而偏移透鏡本身被允許翻譯來回沿著光軸移位的狹縫圖像的位置。 根據預可行性研究單元，物鏡（F）的焦點，而油站的初始化狹縫圖像（A）重合在蓋玻片和介質洗澡標本（圖1（a））之間的界面區域。 這種情況被稱為零點偏移 。 為了引入物鏡焦平面和狹縫參考平面之間的偏移距離，操作者可以轉動的PFS偏移控制器撥號移居偏移透鏡，從而狹縫圖像的焦點。 在圖1（b）中，透鏡是由一個距離 x移動，這導致狹縫圖像焦點A的移位到一個新的位置更靠近物鏡。 因為偏移透鏡對物鏡的成像光波（焦點F）的焦點沒有效果，兩個焦點正在相對 于彼此偏移。 一旦PFS反饋環路調整的物鏡位置，以重新定位于蓋玻片界面的狹縫圖像的焦點（A）（圖1（c））時，物鏡焦點（F）然后，移動到試樣的中心部分。 的焦點F與A之間的距離被稱為偏移量 ，并且可以在操作者來探測在樣品的不同深度的便利而改變。

可與PFS單位的偏移范圍是由所使用的物鏡的類型來確定，但一般的范圍從蓋玻片界面（零毫米）至*多約10微米的用于油浸物鏡，20微米為水浸的物鏡，并且向上至100微米或更長時間干燥的物鏡。 注意，偏移范圍一般隨物鏡的工作距離，所以起到了高數值孔徑油浸物鏡*受限制值，它們具有非常淺的聚焦深度。 一個成功的，能夠監視的Z基準面的軸向位置的*重要的方面是所述近紅外光在界面處反射的信號強度。 當使用油浸物鏡，狹縫圖像的反射率在油和蓋玻片的玻璃之間的界面上是有效的零，因此不具有焦點控制干擾。 用水浸物鏡，在此界面的反射率的值等于該上蓋玻片界面（在試樣上側），但這些高倍率及數值孔徑物鏡的淺焦深可確保較低的反射不與PFS控制干擾功能。 相反，對于干物鏡，反射率在蓋玻片 - 空氣界面是10倍以上，在檢查體蓋玻片界面，所以前者接口被用作焦點控制的基準邊界。 在必要時，使用范圍廣泛的物鏡的可用偏移量的差異可以通過引入適當的炮塔透鏡到光路中來獲得。

在操作過程中，在物鏡位置的控 制，進而，在焦平面成像試樣和PFS狹縫（A和F在圖1中，分別），由狹縫圖像上的線CCD傳感器的投影來確定將PFS單元，如示于圖2。在情況下，試樣攝像室（參考接口）移動的負的軸向（-z）的方向上，狹縫像沿的CCD的像素行的一端移出并變寬。 在反向時，會發生室位移在正方向（遠離物鏡; + Z）在顯微鏡的光軸。 一旦變速時，PFS控制器把物鏡的一種代償方向與狹縫圖像恢復到線路CCD傳感器的中心。 圖2示出的線CCD傳感器作為焦點位置的函數的狹縫圖像的信號強度（z）表示 。 當PFS狹縫光直接在參考平面上聚焦，狹縫圖像重疊線CCD的中央部分（圖2（a））。 作為基準面由越來越大的距離，在正的軸向方向移動時，狹縫圖像變寬，并移向線CCD（圖2（b）至圖2（d））的邊緣。 當基準平面移位中的負的軸向方向發生反向。

線路CCD探測器是在PFS系統的一個關鍵因素，因為從狹縫圖像的投影而得到CCD面上的信號被直接饋送到控制電子設備的CPU容納在單元，它解釋焦點信息來確定聚焦狀態相對于參考平面的物鏡。 然后將PFS電子所需的信息輸出到線性編碼器的控制單元（裝在顯微鏡幀），以驅動物鏡轉換到正確的位置。 與PFS中使用的每個不同的物鏡被注冊到控制電子器件，以提供單位與可以用于建立相對于物鏡前透鏡正確的物鏡轉換器的位置數據。 當PFS單元被激活時，物鏡轉換器被驅動為物鏡寄存的垂直位置，然后更接近試樣腔室由一半的工作距離（約65微米為典型的100倍復消色差物鏡的數值）。 在這一點上，PFS單元為參考平面（稱為狩獵 ）搜索，直到它由線CCD的檢測。 在不能檢測到參考平面的情況下，搜索操作的預定義的時間后停止。 過度狩獵可以是一個問題，當不正確的浸沒油被用于或者如果樣品參數不符合PFS單元的要求，導致差的信號檢測由線CCD的兩個條件。 在情況下，水溶液洗澡試樣小于3毫米厚，狩獵或完全故障檢測接口也可以發生。 在理想情況下，該加油站的對焦精度通常是物鏡震源深度小于三分之一。