徠卡顯微鏡GSDIM 樣品制備- 協議和技巧
廣角*分辨率技術GSDIM（基態耗盡之后個別分子返程）是一個定位顯微鏡技術，其能夠解決細節小至20納米。 GSDIM適用于范圍廣泛的樣品。
生長在標準玻璃蓋玻片上的細胞，例如后化學固定都可以使用。 此外組織切片可為GSDIM來制備并放置在玻璃蓋玻片。 樣品通常是通過熒光免疫染色或其它合適的技術標記
免疫熒光
與準備與衍射極限的熒光顯微鏡優化的標準免疫方案樣品開始應該已經提供令人驚嘆的*分辨率圖像。 為了獲得*佳的GSD圖片，可能需要增加抗和二抗的濃度，以達到更高的標記密度。 增加標簽密度，確保感興趣的結構充分沾上熒光。 結構稀疏的標簽可能會導致您的圖像的點狀外觀。 為了減少在GSD圖像的非特異性背景信號，它可能需要增加時間用于阻斷樣品以及阻斷試劑的濃度。 這是應徹底清洗你的樣品（例如，通過增加洗滌步驟的數量和時間）。
雙彩屏染色徠卡Microsystems建議一）AlexaFluor 532與AlexaFluor 647，B）AlexaFluor 555與AlexaFluor 647或c）阿托488或AlexaFluor 488與AlexaFluor 647的組合。
圖1：高爾基體膜蛋白Giantin和高爾基體基質蛋白GM130，免疫熒光染色的Alexa Fluor 647和Alexa Fluor 488，分別。 禮貌靖岡田博士，細胞生物學教研室和解剖，醫學研究生院，東京大學，日本。
圖2：MDCK細胞：微管，AlexaFluor 647（紅色）和TyrMicrotubules，AlexaFluor 488（綠色）。 禮貌教授拉爾夫·雅各布，菲利普斯大學馬爾堡，德國。
結構保存
一個特定的蜂窩結構體的保存強烈依賴于固定方法。 確切的固定方案，應針對感興趣的結構進行優化。 對于大多數結構的多聚甲醛/甲醛固定就足夠了。 除了多聚甲醛/甲醛作為fixant少量戊二醛（0.05％至0.2％（體積/體積））的可強烈提高結構保存。戊二醛可誘發一種朦朧的熒光背景，因此與銨淬火， 硼氫化鈉或其它合適的試劑推薦。 甲醇固定是很常見的微管保存，但可能不足以為其他結構。
蓋玻片
*分辨率成像需要在整個光學系統的良好的光學性能 - 不僅在顯微鏡和物鏡。 蓋玻片是對成像效果高沖擊的主要參數。 以獲得*佳的*分辨率圖像質量的扁平蓋玻片是必需的。
不幸的是，雖然是不加批判的標準廣角應用，不是所有的腔蓋玻片的產品可以保證*佳的平整度就GSD的程度。 此外，腔蓋玻片的產品可能不適合高分辨率成像提供必要的機械穩定性。 相應的產品應該由研究員為他們的適應性測試。 一個更好的平整度和高穩定性可通過在玻璃蓋玻片，例如在特別設計的蓋玻片持有者的無應力安裝通常被實現。
在我們的情況下，我們為簡單和扁平推薦的另一種方法蓋玻片安裝專門用于GSD成像利用高精確度的蓋玻片和硅酮膠來固定和密封所述樣品（參見下文）量身定做。
嵌入
包埋劑 - - 每個熒光團與它的直接環境相結合的固有特性決定了基態損耗的能力，以及對單分子的回報率。 有了它，包埋劑效力于成功的GSD成像至關重要的作用，并具有與利用熒光對齊。 到現在下面越來越多的機會是適用的。
包埋劑1 - MEA在PBS
試劑
β-巰基乙胺（MEA）（例如，Sigma-Aldrich公司，＃30070，也被稱為半胱胺）
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中
HCl / NaOH調節pH調整
緩沖
PBS中含有10mMβ-巰基乙胺（MEA），調節至pH 7.4。 溶解的β-巰基乙胺在PBS中并調節至pH 7.4。 β-巰基乙胺的濃度可以改變，在很寬的范圍內，以優化GSD圖像 - 使用范圍一般是10和100毫米之間（建議濃度為測試31/30/100毫摩爾）。
β-巰基乙胺溶液必須在使用前新鮮配制，另外，儲液可制備并儲存于-20℃并在使用前剛解凍。 冷凍的等分試樣可被存儲在幾個星期。
照明
EPI：是
全內反射熒光：是
激光（波長） | 染料 | 生產廠家 |
|---|---|---|
488 | AlexaFluor 488 | 生命技術 |
阿托488 | 西格瑪 | |
做Chromeo 488 | Active Motif | |
俄勒岡綠488 | 生命技術 | |
做Chromeo 505 | Active Motif | |
532 | 阿托520 | 西格瑪 |
AlexaFluor 532 | 生命技術 | |
AlexaFluor 555 | 生命技術 | |
AlexaFluor 568 | 生命技術 | |
642 | 阿托633 | 西格瑪 |
AlexaFluor 647 | 生命技術 | |
阿托647N | 西格瑪 | |
阿托655 | 西格瑪 | |
AlexaFluor 680 | 生命技術 | |
AlexaFluor 700 | 生命技術 |
包埋劑2 - 葡萄糖氧化酶
試劑
葡萄糖氧化酶（如Sigma-Aldrich公司G2133）
過氧化氫酶（如Sigma-Aldrich公司C1345）
葡萄糖
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中
的HCl / NaOH調節pH調整
緩沖
PBS中含有10％（重量/體積）葡萄糖，0.5毫克/毫升葡萄糖氧化和40微克/毫升過氧化氫酶調節至pH 7.4。
注：建議準備一個葡萄糖母液和安裝蓋玻片前新鮮混合試劑。
照明
EPI：是
全內反射熒光：是
激光（波長） | 染料 | 生產廠家 |
|---|---|---|
532 | 阿托532 | 西格瑪 |
AlexaFluor 532 | 生命技術 | |
AlexaFluor 555 | 生命技術 | |
羅丹明6G | Active Motif | |
阿托565 | 西格瑪 | |
AlexaFluor 568 | 生命技術 | |
642 | 阿托655 | 西格瑪 |
AlexaFluor 680 | 生命技術 |
包埋劑3 - 聚乙烯醇
試劑
聚乙烯醇（PVA）為25000，分子量，88％（摩爾）水解（例如Polysciences的，＃02975-500）
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中
的HCl / NaOH調節pH調整
硬件
Spincoater
緩沖
制備在PBS中的1％PVA溶液。 將pH調節至7.4。
旋涂
將蓋玻片上的spincoater及干燥，短暫5-10秒旋轉蓋玻片在約 3000轉。 滴50微升的PVA溶液的樣品上并旋轉該樣品在約 3000 rpm離心約30秒。 讓該PVA膜干燥幾分鐘并裝載樣品。 可將樣品在室溫下保存，并用于GSD成像長達三個月。
沒有額外的安裝介質是必需的。 PVA膜，保護樣品。
照明
EPI：是
TIRF：不可能
激光（波長） | 染料 | 生產廠家 |
|---|---|---|
488 | AlexaFluor 488 | 生命技術 |
阿托488 | 西格瑪 | |
做Chromeo 488 | Active Motif | |
俄勒岡綠488 | 生命技術 | |
阿托520 | 西格瑪 | |
532 | AlexaFluor 532 | 生命技術 |
AlexaFluor 680 | 生命技術 |
包埋劑4 - 的Mowiol
試劑
甘油（分析純）
MOWIOL 4-88（例如Calbiochem公司＃475904）
蒸餾水
三
的HCl / NaOH調節pH調整
包埋劑
開始6克甘油
添加2.4克4-88的Mowiol
添加6毫升水族dest中。
添加12毫升0.2M的Tris緩沖液pH值8
攪拌4小時（磁攪拌器）
讓我們暫停休息2小時
孵育10分鐘，在50℃（水浴）
離心機在5000×g離心15分鐘
取上清液，并在-20℃下凍結它在等分
照明
EPI：是
TIRF：不可能
激光（波長） | 染料 | 生產廠家 |
|---|---|---|
488 | 阿托488 | 西格瑪 |
做Chromeo 505 | Active Motif | |
532 | AlexaFluor 532 | 生命技術 |
羅丹明6G | Active Motif | |
阿托647N | 西格瑪 | |
642 | 阿托655 | 西格瑪 |
AlexaFluor 700 | 生命技術 |
包埋劑5 - 的Vectashield?
試劑
Vectashield?（如Vector Laboratories公司，＃H-1000）
50牛米三甘油中
HCl / NaOH調節pH調整
緩沖
的50mM Tris /甘油含有緩沖液的10％的Vectashield?調節至pH 7.4。
三溶解于甘油準備一個50毫米原液。 混合10％的Vectashield?與90％的Tris /甘油緩沖。 調節pH至7.4。 樣本可以被存儲在數周，在4°C。
照明
EPI：是
TIRF：不可能
激光（波長） | 染料 | 生產廠家 |
|---|---|---|
532 | AlexaFluor 555 | 生命技術 |
642 | AlexaFluor 647 | 生命技術 |
包埋劑的YFP
GSDIM適合創建使用熒光蛋白的*分辨率圖像。 如熒光蛋白YFP /金星***的顯示效果。 此外，其他的熒光蛋白質應與該技術（包括GFP）。 要結合與基因編碼的融合蛋白的優點有機熒光電源（例如，如果沒有合適的抗體可用），使用標記，如SNAP-，鹵素或CLIP-標簽建議。 這些標記可以遺傳地與感興趣的蛋白質和后標有有機熒光團（例如，固定和透化后）。
下面的水嵌入被成功用于圖像YFP在固定和通透的哺乳動物細胞：
過氧化氫酶SIGMA，C1345 40微克/毫升
葡萄糖氧化酶SIGMA G2133 0.5毫克/毫升
葡萄糖10毫克/毫升
β-巰基乙胺（半胱胺）1毫米
在PBS中稀釋，調節至pH 7.4
安裝
徠卡Microsystems建議安裝蓋玻片直接對抑郁癥的幻燈片樣本。 蓋玻片應該固定在凹部滑動，并與雙組分硅酮膠Twinsil?（Picodent，維佩菲爾特，德國，＃13001000）密封。 Twinsil?是無毒的，快速硬化，并且可以在稍后容易地除去，例如，重新裝載樣品。
加90微升水包埋培養基（MEA中，葡萄糖氧化酶，混合或的Vectashield?）到一個干凈的抑郁滑動的空腔。
（對于嵌入媒體PVA和LR-白：離開抑郁癥幻燈片的腔體為空。）將您的樣品的玻璃蓋玻片上的抑郁癥幻燈片的腔。 樣品應面對腔。 蓋玻片應完全覆蓋抑郁癥。
如果水性包埋介質被填充在腔體中，確保沒有氣泡存在。 否則，小心地取出蓋玻片，并重復上述步驟。
無液體應該出席的地區，應膠水覆蓋（Twinsil?）。 小心地用濾紙除去殘留的液體。 對于嵌入媒體1，2和5：確保沒有緩沖區是從水庫浸泡出來。
混合的Twinsil?黃色和藍色分量的1 +1徹底的數量，并把它應用到玻璃蓋玻片的邊緣不直接接觸蓋玻片。
用于水性嵌入媒體：與Twinsil?完全密封蓋玻片。
嵌入媒體PVA和LR-白：密封蓋玻片約。 75％，其余的四分之一開放，允許通風，避免對樣品冷凝。5-10分鐘后的雙組分膠硬化和試樣準備GSD成像。
該膠可在不硬化（如交換成像緩沖區）后不留痕跡在玻璃上很容易地刪除。
AlexaFluor?是生命科技的注冊商標?。
安裝步驟
1）移液管約。 90微升的液體包埋介質（例如，MEA溶液）放入凹陷滑動的空腔。 |
| ||
2）將圓形蓋玻片 - 抱著免疫染色樣品 - 到介質上，并避免氣泡的形成。 |
| ||
3）輕輕按壓在蓋玻片，以去除氣泡（如有必要）和過量的緩沖液。 |
| 混合使用這兩種成分- Twinsil硬化?開始混合。 | |
4）小心地取出液體不從抑郁癥幻燈片水庫浸泡緩沖區。 |
|
|
|
5）通過仔細地適用Twinsil?密封蓋玻片。 請勿觸摸或移動蓋玻片！ |
|
| |
6）當硬化（約5分鐘）Twinsil?是輕輕地用尖感動，也不會粘也不能推到一邊。 |
|
影像學提示
雙色染色
徠卡推薦的組合
一）AlexaFluor 532與AlexaFluor 647
二）AlexaFluor 555與AlexaFluor 647
三）阿托488或AlexaFluor 488與AlexaFluor 647
對于連續雙彩色成像。 請先圖像的紅色通道（AlexaFluor 647）。 徠卡不建議在開始成像綠色/橙色通道（如AlexaFluor 532），以避免AlexaFluor 647，它可以是漂白 - 雖然在非常低的水平 - 興奮由488納米（或532 nm）的激光。 如果打算使用其它熒光團為雙染色的樣品時，請確認這兩個熒光團可以相同GSD成像條件（包埋介質）下進行成像和串擾是微不足道的。
圖3：PTK2細胞AlexaFluor 647染色的微管在綠色紅色和AlexaFluor 488染色網格蛋白。 禮貌教授斯特凡地獄，馬克斯 - 普朗克生物物理化學研究所，哥廷根，德國。
利用405 nm激光
徠卡SR GSD配備一個405nm的激光器。 在關斷狀態的熒光團的壽命可以通過用UV光還照射樣本被縮短。 較短的壽命會導致導通狀態的增加熒光基團，因此可用于增加每幀檢測到的事件的數目。 通過保持每幀的事件在一個*佳的范圍內的數，可以是a）有效地檢測分離良好的單熒光團和b）保持獲得的*分辨率圖像短的時間，因為它有可能積聚所需數量更少的圖像內的事件。
當獲得雙彩色圖像的較長波長信道，必須小心使用405 nm激光是很重要的！ 在405nm的波長可激發的綠色染料，因此漂白較短波長的熒光基團而獲得的較長波長的*分辨率圖像。 *佳設置應分別為每個樣品類型而定。
活細胞*分辨率成像
*近的報道已經研究GSDIM（也稱為dSTORM）的圖像的活細胞中的適用性。 在一般情況下，它是可能的，研究活細胞與Leica SR GSD，而是光毒性 - 如所施加的高功率激光的結果 - 和感興趣的觀察期內結構的動力學應仔細控制。