奧林巴斯顯微鏡激光系統的光學顯微鏡

 通常用于光學顯微鏡的激光器是高強度的單色光源，這是因為對各種技術，包括光學捕獲，壽命成像研究中，光漂白恢復和全內反射熒光的工具是有用的。 此外，激光也是最常用的光源掃描共聚焦熒光顯微鏡，并已動用，雖然不經常，在傳統的寬場熒光調查。

激光器發出單色光的激烈包是一致和高度準直，以形成緊密的光束擴展率非常低。 相對于其他的光源，由激光器發射的極純的波長范圍內具有由鎢鹵或弧光放電燈無雙的帶寬和相位關系。 其結果是，激光束可行駛長距離和可擴展以填充孔或聚焦到與亮度的一個高層次的一個非常小的點。 除了共同所有的激光器，其中包括一個增益介質（光源），激發源（電源），以及諧振器的相似性，這些光源的大小從根本上有所不同，成本，輸出功率大，光束質量好，功耗和運行壽命。

大多數激光系統產生的單色光的相干介紹了這些光源古典廣角鏡的應用問題。 通過干擾在每個表面在光路中的光散射和衍射圖譜進行了介紹。 此外，本領域和孔徑光闌，以及污垢，也產生偽影。 這些不良影響可以被最小化或通過各種技術消除。 最常用的方法包括通過在時間上快速變化的光源和顯微鏡之間的光路長度，或在掃描試樣逐點因為是在共聚焦顯微鏡系統的情況下的加擾的激光。 此外，干擾和其他構件常常可以通過光圈掃描技術消除。 如果激光束的光路長度或相干性狀態波動以更快的間隔比檢測器的積分時間（實際上是視頻幀速率），散斑和散射偽像從圖像中消失。

一個成功的技術，通過一些調查來改進微分干涉對比（DIC）與氬離子激光光源產生的圖像是定位一個圓形玻璃楔形，紡紗每分鐘2500圈，在光路。 在光路長度的快速變化是由在楔厚度的差異引入楔形旋轉擴展的激光光束的前方。 目前，路徑長度的變化通常是通過采用光纖光導管，以便將光源和顯微鏡之間的光來實現。 振動的纖維生產中的光路長度連續變化，使光束成為在時間上不連貫在低于該水平振動的頻率。 的振動可以由壓電裝置，揚聲器，或在激光頭中使用的冷卻風扇產生。

如圖1所示，是一種自鎖模鈦：藍寶石激光脈沖，這是目前在大多數多光子熒光顯微鏡調查的優選激光激發源之一。 鈦藍寶石鎖模激光器提供一個大的波長的調諧范圍，從大約690至超過1050納米，與脈沖寬度，長度約100飛秒。 此外，這些激光器具有足夠的功率（大于100毫瓦在整個調諧范圍）的雙光子激發的熒光團最飽和。 以確保適當的冷卻和激光晶體的濕度控制，將氮氣泵入密封的激光頭，這是由一個外部冷卻器保持在恒定的溫度。

許多激光系統所產生的光被線性偏振，與垂直取向的偏振矢量。 這個屬性可以被利用于需要偏光照明光源，如微分干涉相襯，偏光測量，或熒光偏振各向異性定量調查申請。

激光束的相干性和偏振特性是由光的光束的橫截面，或簡檔，其利用從所述激光的出射反射鏡的距離的增加改變了分布測定。 的激光束的特性下面的討論是作為可能證明在采用激光顯微鏡中成像，激光俘獲和其他應用有用的受試者的一般概述。

當激光器工作在最簡單的橫向電磁模式中 ，被稱為TEM（00）模式下，所發射的光束具有平面波陣面和高斯強度（輻照度）的配置文件。 激光束直徑通常被定義為在該強度已經下降到E（E-2）（13.5％），其峰值價值。 激光束的高斯分布的產生是由于衍射，從而防止一個完全準直光束的傳播和誘導橫向傳播的光波的。 附近的激光輸出孔（稱為近場 ）中，光束的相位方面可以變得紊亂。 作為結果，該波束的橫截面形狀，尺寸和輻照剖面，然后迅速用從激光距離發生變化。 在更遠的距離（ 遠場 ），相位戰線穩定到所得的高斯分布。 在一些參考文獻中，在近場和遠場被稱為由菲涅耳區和夫瑯禾費區域的替代術語分別。 近場有時也被稱為瑞利范圍。 遠場開始的距離，Z，由定義

其中，A（0）是光束直徑在出射孔徑，λ是光由激光器發射的光的波長。 應用此公式來氬激光發射一個0.6毫米的腰部直徑的光束在488納米的波長，遠場開始于從所述出口孔約74厘米。

示于圖2是激光束的幾何形狀和發散的近場和遠場的示意圖。 如上面所討論的，光束可以被認為基本上是波陣面的平行束即經歷在近場小擴散。 超出近場，光束發散角（θ），這是從光束的中心測量到的邊緣（E（E-2）），變大并成為關鍵的參數中，根據確定的光束直徑（D）的公式：

其中D是可變表意激光束的直徑，L表示從激光出口孔徑的光束上的測量點之間的距離的長度。 在實踐中，一些激光束特性，包括輻照剖面，在許多顯微鏡應用的關鍵因素，并在遠場的距離的知識，可能需要在配置的攝像系統。 表1給出了計算出的該距離的值（使用上面給出的方程）為一些普遍使用的激光和發射線，和典型的束腰直徑。

與否的光束呈現高斯字符是在大多數激光應用中很重要，因為光束通常必須集中，形狀和其他由透鏡和其他光學元件修改。 高斯光束具有一定的自定義轉換特性，而這些假設能夠將對于該光束將如何傳播通過光學系統。

角半徑（或光束發散角，見圖2）中，θ（弧度）指定，高斯光束在遠場的近似的表達式：

其中，a（0）是光束束腰半徑在激光出口孔徑。 束腰直徑是激光波長，諧振腔長度，并且所述腔的其它設計參數的函數。 如從激光的距離增加，（z）的光束束腰半徑由下式給出：

通常，激光束的特征是光束傳播參數，如M的平方，或K（相當于M的平方的倒數），從近場和遠場測量的組合來確定，如下所示：

M ^2，這被稱為傳播常數或傳播因子的較 小的值，均顯示出較高的光束質量，特別是在參照的較小直徑和發散。 該因子描述了實際光束的該理想高斯光束的關系。

相干高斯光束有導致他們從非相干光束通過透鏡和反射鏡，會有不同的傳輸變換的特定屬性。 在一個衍射極限的光束的情況下，一個高斯光束的強度分布是高斯分布本身，只要該光束不通過透鏡孔徑截斷。 當高斯光束的直徑是透鏡的二分之一的開口直徑時，射出光的強度分布保持高斯。 當高斯光束直徑等于鏡頭的光圈的直徑，輸出光束的強度分布是高斯函數的和的混合物中，一個艾里斑。 最后，高斯光束直徑比透鏡孔的直徑較大的顯著產生的艾里斑的輸出配置文件。 在后一種情況下，大部分的激光功率可以由于透鏡入射孔徑滿溢丟失。

高斯光束光學系統的整體主題的全部內容在許多教科書中，并在此不再贅述細節可以從更全面的來源。 兩種類型的操縱高斯光束是特別感興趣的，利用激光顯微鏡技術的- 束濃度和擴束 。

當激光束是由一個無像差顯微鏡物鏡（光束濃度）聚焦成一個非常小的光點，光點的焦點處（在距離 z）的半徑由下式給出的表達式：

其中 f是透鏡的焦距。 作為一個例子，如果使用具有1.3的數值孔徑（產生約1.6毫米的焦距）一個100x物鏡集中具有0.3毫米的半徑，聚焦光點半徑（測定的氬激光器的488納米的光束從前面的方程）為0.8微米。 通過擴束五倍增加光束束腰（如下面討論的）將導致約0.16微米的聚焦光斑半徑。

要注意的是極高的功率密度在濃縮的激光束的焦點來實現這一點很重要。 一個10毫瓦的光束聚焦到衍射極限的光點0.22微米直徑的結果在每平方厘米約30百萬瓦特的功率密度。 這樣高的能量水平可迅速降解或破壞透鏡和濾光器的涂層，以及引入到生物標本相當大的光化學損傷。 然而，對于這樣一個微小光點的大小，熱能的擴散可以是非常有效的水，一個高能量，近紅外線光束可以做小損傷的生物試樣，除非由試樣吸收的能量是足夠高的。

激光器在光學顯微鏡的許多應用中，激光束首先通過使用開普勒或伽利略擴束器，其中任何一個實際上是顛倒望遠鏡（典型的激光光束擴展解剖特征示于圖3）的展開。 一個相干高斯光束的發散度可以減小，并且光束最佳準直在較長的距離，如果激光束被第一膨脹。 參照前面的方程組，該光束的角半徑，指定θ，是成反比的光束束腰半徑，A（0），在激光出射孔徑。 因此，擴大束腰半徑按比例減小的分歧。

它是實用的許多應用中顯微鏡管激光輸出直接進入顯微鏡的光路通過柔性的光纖（如圖4）。 這種技術是最好的嚴格對準激光和顯微鏡，這就需要采用一個巨大的，無振動的光學平臺和眾多的固定反射鏡等組成的替代方法。

當激光束通過透鏡聚焦到光纖，耦合效率，并且出現從纖維束的特性在很大程度上取決于纖維幾何形狀。 大多數用于激光輸送光學纖維都與一個石英芯構成。 這些纖維包括制造具有高折射率的二氧化硅和由套筒環繞的內芯的，稱為包層 ，低折射率材料構成。 防止光從沿其長度由在纖芯和包層的界面的全內反射逸出的纖維。 包層可以由二氧化硅，玻璃，硬質的氟聚合物，或柔軟的硅樹脂制成。

光纖按照其內芯的直徑分為單模或多模 。 一種單模光纖允許的只有最低階模式的傳播在一個特定的波長（圖4）。 波長傳播和偏振保存的波是由纖維直徑來確定。 雖然其他波長可以傳播，他們這樣做降低效率。 典型的單模光纖直徑范圍從3到6微米為可見光波長的光，并且單模光纖的輸出光強分布是高斯型的。

一種多模光纖允許多于一個模的傳播，并且不局限于單一波長。 多模光纖的內芯比單模光纖，范圍從約100微米至1.2毫米的直徑。 從多模光纖的輸出輻照剖面的扁平形狀，稱為頂帽輪廓 ，帶是由核心確定和包層的折射率的數值孔徑。

驗收錐角纖芯，θ，是關系到數值孔徑光纖的NA，如下所示：

其中，n表示折射率。 光纖纖芯的數值孔徑，而光束濃度透鏡的匹配時發生的激光到光纖芯的高效耦合。 光傳輸通過光纖的效率通常高達約90％，但也可以大幅降低（僅60％或70％）的由具有非常小的半徑（小于3厘米）的彎曲。

在利用任何激光，至關重要的是，不僅防止任何直接或鏡面反射激光光線入射到觀察者的眼中，但是也避免了光束的反射從光學系統的一個組成部分回到激光器系統。 前者是一個明顯的人身安全預防措施，而后者則謹慎重要的是要避免一個額外的反射器從返回一個相干光束返回到激光，從而導致可能對系統的損害。

激光光源的穩定性是在許多應用中的一個重要方面，尤其是在定量顯微術，其中光照強度的波動可以實驗結果產生不利影響。 一些相關的受激輻射和腔長的波動因素可以誘發的輸出光束頻率的噪音，但造成的波動幅度等擾動可以建立在光輸出功率均為高頻強度噪聲和緩慢變化（漂移）。 這些強度波動的一些來源都涉及到激光頭本身或電源的功能。 在輸出光束的各種激光器類噪聲的最常見的來源如下：

• 氣體激光器 -從諧振器的振動，從光泵浦源，等離子體振蕩和離子放電過程中的不穩定噪聲，在電源電流的波動，從冷卻水的湍流顫，而在強制空氣冷卻系統風扇引起的噪音鏡象偏差都潛在的噪聲源。

• 固態激光器 -噪聲源包括顫，為燈和二極管泵浦源，腔對準誤差和隨機頻率相關的噪聲泵浦源的波動（稱為1 / f噪聲），是關系到激光介質的熱波動。

• 染料激光器 -兩個噪聲（高頻）和密度的不均勻性和氣泡在染料溶液中漂移的結果，和由染料和泵激光泵源的不穩定性。

• 半導體（二極管）激光器 -噪音可導致從驅動器中（偏差）的電流或溫度，和1 / f噪聲是因在結載波的捕獲和由其他類型的載流子（電子-空穴）復合效果的波動。

所有的激光是比較容易受到他們的電源引入的噪聲。 開關電源，這已成為因為他們的效率和小尺寸普遍，特別容易引入紋波激光系統的頻率范圍到幾十千赫。 這樣的干擾，當它影響光束在光學顯微鏡系統，可能是特別麻煩的診斷與排除。 主要的困難是由于具有相似的噪聲由其它來源，如在實驗室環境中電磁場引入到系統中。 為了實現足夠的輸出穩定性，半導體激光器必須具有二極管的電流供應的最高電穩定性和噪聲最低可用的，并且具有精確的溫度控制下操作。 其他外部噪聲源必須加以控制，包括粉塵在實驗室和振動當地交通和建筑設備發起。

連續波（CW）激光束強度可以通過電子控制的管電流或通過利用該調制光強度的外部元件的穩定化。 兩種不同的方法被經常采用，以控制管的驅動電流。 在恒定電流方式中，管電流直接通過電子反饋回路，以減少波動的控制。 因為激光輸出也隨溫度變化，如果提供足夠的溫度控制這種類型的控制電路是最有效的。 恒定輸出功率穩定系統，通過控制驅動電流以響應于來自該輸出光束通過該樣品的電路產生的信號操作一個分束器和光電二極管顯示器。 該物理安排適用于氣體激光器和其他一些幾何形狀，但更小的半導體激光器通常被裝配在已經包括一個不可分割的光電二極管的封裝。 從激光晶片的后方端面的監視器光電二極管的樣品發射，并產生一個信號，使輸出功率的反饋控制。

用于提供激光強度穩定的外部元件通常采用的快速反饋系統來控制的電 - 光調制器，最大限度地減少在光束功率的波動。 外部普克爾盒調制器（見圖5）是可從許多制造商，并且可以使用，原則上，以穩定的任何連續波激光的輸出功率。 大強度的波動（最多約50％）可以通過該技術得到糾正，但有一個比例減少，總的輸出功率。 廣泛的糾錯能力是有許多系統非常重要。 氦 - 鎘激光器，例如，可以表現出變異的20％左右的輸出功率，部分原因是由于某些束頻率之間的強等離子體振蕩。 系統存在所報告的是適合于它們的輸出功率的百分之幾百分之調節CW和鎖模激光器來，并在一個頻率范圍從直流到幾百兆赫，具有500:1噪聲衰減或更大。

一普克爾盒調制器的基本組件示于圖5。 用于調節激光的輸出強度，類似于在圖5所示的設計的外部設備，有時被歸類或下一詞噪聲食銷售。 后面利用Pockels效應電光調制器的基本概念是基于一種機制，以極快的速度，以提供一種可變光束衰減器，用于激光強度的變化控制單元的偏振特性。 激光輸出的偏振狀態決定了調制器的總衰減，但高達80％的傳輸是可能的。 以下，從激光頭發射的光束的一部分由分束器轉移到一個光電二極管，它的強度進行比較，以預先設定的（可選擇）基準強度，并放大該差信號，以便它可以驅動電光普克爾盒調制器。 放大后的信號產生的折射率變化在旋轉偏振平面的細胞，從而正比于所施加的電壓差改變所述光束的衰減。 中表現出的變化的電場（普克耳斯效應）的偏振特性變化的物質是磷酸二氫鉀和鈮酸鋰，以及這些材料的晶體在光束調制器通常被利用。

在其中隨機偏振的光，由普克爾盒系統穩定的情況下，調制器必須定位，交叉的偏振器之間，以及進一步的考慮是必要的，以減少這些附加部件上的光束的穩定性的影響。 因為灰塵，振動和其它干擾，可以在光路中的任何一點改變光束的穩定性，重要的是外部的穩定劑被置于盡可能接近，以在光學顯微鏡系統的樣品位置。 這種努力將確保最穩定的光束被輸送到樣品。

無論是氬離子激光和氪離子激光器產生的稀有氣體的轉換差別很大的功率水平，并且只有少數的線適合于顯微鏡應用多個發射線。 風冷氬離子激光器被廣泛地用作，因為它的亮度級，尺寸小，優良的光束的幾何形狀，以及對于它的熒光譜線的適用性和（效率降低），若丹明激發光源，用于激光共聚焦顯微鏡。 在寬視場或共聚焦熒光顯微鏡利用最氬離子激光器發出只有兩個可用的線路，488和514.5納米，相當于約75％的總激光功率。 高功率（大于5瓦）氬離子激光器配備專用反射鏡可以在334發出紫外光線，351，和364納米，并且在從458到529納米的延伸可見波長的其他行。

氪離子激光器已經發現在顯微鏡比氬激光器由于其稍微長波長輸出較少的應用程序。 此外，氪在同一管使用時只產生10％到30％之多功率為氬氣，而且經常需要水冷卻以產生等效的功率輸出空冷氬的系統。 風冷離子激光器的一個主要缺點是缺乏效率的，這會導致大的功率要求，并產生過多熱量，必須從系統中排風扇被除去的強制空氣。 離子激光器的壽命降低，由于氣體的消耗，以截留氣體被埋沒在放電管的壁內，根據需要為激光操作的高電流密度的結果。

使用氬 - 氪混合物風冷激光器已經成為在共聚焦顯微鏡流行時所需要的雙重或多重熒光研究幾個照明波長。這種混合氣體激光器是唯一能生產穩定的輸出上都波長光譜以及分離的主要線路。 通常用于共焦顯微鏡三個激光線，488納米和568納米線具有大致相等的功率（10?15毫瓦），而647納米線具有大約50％以上（15?25毫瓦）。 所有離子激光器表現出優異的光束質量，并且可以從在單線，多線，并且可調諧的配置不同的制造商處購買。

在632納米的共同氦氖激光（稱為氦氖線 ）的排放已補充的具有綠色排放量（543納米），黃色（594納米），橙色（612納米），紅的變體發展（633納米），和近紅外（1523納米）的光譜范圍。 盡管大多數這些激光器是單線發射器和相對較低的功率（小于10毫瓦），氦 - 鎘激光器是一個例外，以大于50毫瓦的功率發射在325或442納米。

氦-鎘激光器（在圖6中示出）被認為是氦-氖家族的成員，并代表了一種經濟來源為連續波輸出中的紫外線（325納米，在75毫瓦和353在20毫瓦）和紫（442納米，在200毫瓦）的光譜區。這些激光器依靠鎘蒸氣作為激光介質，它是由被加熱的鎘貯存器（攝氏約250度）由氣相電泳均勻地分布在整個孔中。氦泵保持恒定的氦氣的壓力，這是比鎘蒸氣的高約一千倍。氦鎘激光顯示更多的束噪聲的金屬鎘蒸氣濃度在孔局部的波動，主要是因為他們比氦氖同行。他們也有一個生命周期較短，一般約5000運行小時數。（本文來源：奧林巴斯顯微鏡激光系統的光學顯微鏡）

一組研究人員已描述了使用一個比成像的共焦顯微鏡耦合到氬激光器在488納米的操作和氦-鎘激光發射在442納米。該系統使本集團能夠從pH敏感的染料測量的強度比BCECF [具有IUPAC的2名'，7'-二（2 -羧乙基）-5 - （和-6 - ） -羧基]在孤立腎小管。類似的測量已利用在兩個寬視場和共聚焦顯微鏡系統的氬激光器的458納米線。用氦-鎘激光器的325納米的輸出來同時激發兩種染料，并執行發射率成像另一份研究報告。

氦氖激光器是最廣泛使用的激光系統的范圍廣泛的生物醫學和工業應用，并顯示任何激光的最優越的高斯光束質量。 這些激光器都是現成的成本相對較低，具有緊湊的尺寸大小，且具有工作壽命長（通常達40,000至50,000小時）。 低功耗的要求，卓越的光束質量（幾乎純高斯分布），和簡單的散熱要求（對流）使氦氖激光器的選擇系統的許多共聚焦顯微鏡。

示于圖7是一個典型的氦氖激光器系統，它具有大的氧化鋁冷陰極作為電子發射體由玻璃構成的剖切圖。 工作在異常輝光電流密度氣體放電區域，氦氖激光器一般是高電壓，低電流系統，與放電電流被限制在幾毫安和潛力，從幾百到幾千伏。 在陰極上，這最終導致了鋁濺射氧化物涂層的進行性惡化，是在氦氖激光器的工作壽命的限制因素。 大口徑排氣管通常有更長的壽命小于管（40,000小時相對于約10000小時，分別）。

氮激光器已經在使用了數年作為脈沖光源為光譜儀和顯微鏡。 輸出被限制在一個單一的線，有一個337.1納米的波長，脈沖持續時間，從皮秒到納秒。 脈沖重復率可高達200個脈沖每秒。 氮激光器也可以采用泵的染料分子對波長較長的輻射。 此外，這些激光器已被用于作為光源使用紫外線興奮染料Fura-2的高速鈣比成像。 在此應用中，兩個激光器被使用; 1作為337納米的光的直接來源，而另一個是染料泵浦以產生380納米的輻射。 每個脈沖激光在重復率15每秒，在同步的視頻速率，產生一個比形象，每66毫秒。

二極管激光器 ，已經開發了幾十年的半導體器件，現已有足夠的輸出功率有興趣的顯微鏡。 最常見的這些裝置的運行在近紅外的，但半導體激光器中的紅色和藍色的區域（和最近，其他波長的光）下工作，有大量的輸出功率，已經開發出來。 此外，這些二極管激光器現已顯示出改進的波束形狀和穩定性，使他們能夠取代氦氖激光器在許多應用中。 二極管激光器通常有一個壽命10,000至50,000小時之間不等，但對靜電沖擊極其敏感，因此必須小心處理。

的極大興趣光學顯微鏡是可調諧二極管激光器的發展，現在可以在功耗和多功能性方面具有競爭可調諧染料激光器和摻鈦藍寶石激光器（下面討論并在圖1所示）。 可調諧染料激光器具有600至1800納米的波長范圍內，并且可以提供5至功率的25毫瓦。 它們具有相對低的成本，尺寸緊湊，長壽命和低的熱產生的優點，消除了對外部冷卻系統的要求。

二極管泵浦固體激光器（DPSS）利用二極管激光器代替惰性氣體，弧光燈，或flashlamps泵固態激光材料。的功率輸出，光束質量和穩定性通過二極管泵浦激光器表現出接近于氣體（氦氖）激光的，但效率和大小與二極管激光器更具有可比性。 的二極管泵浦激光器典型的操作和維護成本小于氣體激光器，和大多數系統通過對流或強制空氣或冷卻。

二極管泵浦釹-釔鋁石榴石（Nd：YAG激光器 ）激光器產生毫瓦功率范圍1064-納米光。 倍頻導致了緊湊的設備與在532納米的連續波輸出，并且頻率的三倍，也可用于產生一個脈沖輸出在355納米。 采用二極管激光器陣列發電的幾瓦1047納米：（YLF Nd）的高功率和效率緊密折疊諧振器（TFR）泵送的釹-釔氟化鋰晶體的開發。 頻率提高一倍，兩倍，并且在523四倍于這種類型的激光產生的功率輸出高達幾百相干光毫瓦，349，和262納米（第二，第三和第四諧波）。 二極管激光器作為泵浦源的其他優點包括延長的壽命（通常為5000小時以上，相比之下，幾百個小時為燈），準直的和容易集中輸出的固態激光器的激射小體積匹配，并且大大激光棒，這通常需要水冷卻時，鹵素弧光燈作為泵的降低熱負荷。

二極管泵浦固體激光器的發展，推動了需要高功率（一般為幾瓦）的綠色（532或523納米）和紫外線（355或349納米，266納米的四倍頻）工業和商業應用波長范圍。 輸出在紫外光譜區是脈沖，用能量為100微焦耳至10毫焦耳，在納秒級脈沖持續時間和重復率高達10千赫。 這些激光器是在顯微鏡非常有用，用于觸發籠化合物的釋放。 脈沖重復率，但是，仍然太慢用作照明源的大部分共聚焦顯微鏡的應用程序。

進一步發展導致的二極管泵浦固體激光器的組合光參量振蕩器（OPO的，參見圖8），以產生一個可調，脈沖輸出，從205納米無級變速至2000納米。雖然最初可用的系統已經昂貴和復雜的操作時，按比例縮小的版本更適合于顯微鏡的使用正在推出。

摻鈦藍寶石激光器（俗稱鈦藍寶石激光器，參見圖1）提供可調諧的優點為脈沖和連續光傳遞，以及固態可靠性。這些激光器可以在高重復頻率（100MHz時）提供非常短的光脈沖（約80至100飛秒）。可調諧波長的范圍從遠紅延伸到近紅外光譜區（700?1000納米）。大多數這些激光器是由高功率的氬激光光泵，以及不需要水冷卻操作。由于涉及操作和維護的Ti的費用和復雜性的結果：藍寶石激光器，它們的使用受到了限制主要是為了多光子顯微鏡在相對 較少的實驗室。

最近，一個二極管泵浦的Cr：LiSAF（摻鉻鋰鍶氟化鋁）激光已經開發，提供高頻率的90飛秒脈沖在860納米的波長，和88毫瓦的平均輸出功率。小尺寸和鉻的低功耗要求：LiSAF激光器使其代替鈦的一個有吸引力的光源多光子熒光顯微鏡：藍寶石激光器。

結論

其中多光子和激光共聚焦熒光顯微鏡之間的主要區別是激光在這些經常是互補的技術，使用的類型。激光對多光子顯微鏡是相當昂貴和困難比在激光共聚焦顯微鏡使用的小型風冷激光器進行操作。

人性化的交鑰匙激光源的多光子顯微鏡的發展是必要的，如果該技術是注定要得到廣泛的接受。迄今為止，多光子調查的范圍是由激發光波長的限制選擇通過合適的激光照射源提供的限制。為了緩解復雜的激光日常維護計劃，擴大有用的激發波長的光譜，在飛秒時間的光脈沖激光器的新發展是必不可少的。具體而言，新的激光源必須設計是波長可調的整個上部可見的（500 +納米）和光譜的近紅外部分。

在過去的十年中，許多新的短脈沖激光系統的變化是由克爾透鏡鎖模的摻鈦藍寶石晶體激光器的發現成為可能。其他新的系統，例如二極管泵浦固態和單模光纖飛秒激光器正在研究其潛在作為激發源為多光子顯微鏡。在未來，飛秒脈沖激光由光學參量振蕩器（倍頻OPO的）可以提供一種通用的解決方案覆蓋有用波長范圍內。

激光器在顯微鏡的目前應用是在共聚焦顯微鏡，光學捕獲，和籠形化合物和熒光基團的釋放的區域迅速擴大。的緊湊的固態激光器具有發射譜線在光譜的藍色，綠色和紫外區域的開發應有助于進一步提高這些裝置的顯微鏡的利用率。