奧林巴斯顯微鏡，過濾器黑白顯微攝影

 在黑白攝影通過顯微鏡，過濾器主要用于控制在電影拍攝最終圖像的對比度。 這是高度分化的，相對于從生物污漬彩色元素標本被翻譯成灰色的黑白膠片的色調，常常會出現有相同的亮度。 當這種情況發生時，重要的標本細節可以通過缺乏對比度會丟失。 過濾技術的黑白電影顯著有別于那些顏色顯微攝影使用。

要使用黑白顯微更好的圖像樣本，過濾器通常采用有選擇地吸收一種或幾種顏色，使用具有相同的靈敏度，以多個漬色全色膠片時尤其如此。 許多染色生物標本表現出很淡的顏色背景明亮（使用透射明視場光學顯微鏡），記錄在黑白膠片拍攝時，將出現一個白色的背景為淺灰******調。 以提高對比度，彩色濾光器被添加到吸收染色的樣品顏色的顯微鏡光路中，將其定為暗灰色。 對比度可以以這種方式通過選擇性地選擇吸收不同量的污漬顏色的過濾器進行調整。 這個概念進行了探討與沾有含番紅為O（漬核，染色體，木質化和cutinized細胞壁紅色），固綠（漬四倍混合染色圖1給出的顯微照片，它說明了一個薄的馬鈴薯 （土豆）節細胞質和纖維素的細胞壁綠色），結晶紫（漬淀粉粒紫色），和橙G（漬嗜酸性細胞質和細胞壁黃色變為綠色）。

在圖1所示的顯微照片（a）采取了與明照明，并使用富士正片64T透明色（反轉）膜中性密度濾光片。 此圖片顯示的淀粉粒與番紅O和結晶紫染色主要塊莖矩陣，而標本的其余部分由纖維素和綠色的染色與固綠和橙G。圖1（b）顯示了相同的拍攝現場使用細胞壁柯達的T-100最大（連續色調全色黑與白負片），但與柯達雷登25號紅色濾光片（見表2）插入顯微鏡光路。 試樣的紅色區域由過濾器，其中還介紹了在被染成藍色和綠色的標本細節反差太大降低對比度。

柯達數字47B藍色濾光片置于顯微鏡的光路為記錄在圖1（c）中所示的顯微照片。 有了這個過濾器，淀粉粒已經獲得增強的對比度，但標本的綠化面積正喪失對比度和細節。 圖1（d）示出了當一個柯達數字濾波器58（綠色）被置于光路中的檢體。 時相比，圖1（b）該綠色濾波器增加了淀粉顆粒的對比度，但會降低在染色用綠色染料區域的對比度。 整體對比度進行優化，在圖1（d）給出的顯微照片。

作為一般規則，采用彩色濾光片的黑白顯微攝影時，利用過濾器是免費贈送給標本染******（它們吸收了大部分的污點傳播的主要波長），以最大限度地提高最終圖像的對比度量。 為了達到對比中等水平，使用過濾器，只有部分吸收最感興趣的功能顯示的顏色。 最后，為了降低反差降至最低，使用有顏色的那些相同的試樣的過濾器。 過濾器的組合可以被用來提高在標本染色與一個以上的色彩細節的對比度。

表1可以被看作是一個條形圖的匯編較常見的生物污垢的吸收光譜。

大多數生物標本缺乏足夠的顏色和對比度使用明場照明，以容易地成像在光學顯微鏡下。 這些樣品通常不吸收可見光任何大的程度（它們不是好的振幅標本），并且可以被看作是一個粗略輪廓的一些內部細節僅當聚光鏡孔徑尺寸減小了，常常引入光學構件的點。 為了解決這個問題，經常顯微鏡治療生物細胞和組織反應性的有機染料會選擇性地染色和顏色的生物體系結構的各個部分是。 因為背景往往會出現白色或非常淺的灰色在明顯微鏡，染色的組織會出現彩色的，疊加在淺色背景。 這是常常足以使感興趣的可見的細節和有足夠的對比度，以提供良好的顯微照片。

在許多情況下，不同顏色的兩個或更多的污漬進行組合，以幫助該躺靠在一起的蜂窩單元之間區分，產生了顏色對比度，從另外一個分開的一個元素。 例如，細胞的細胞核可以用蘇木精，從缺口洋蘇木，其選擇性地結合到染色質中提取的天然無色化合物。 為了提供此相反，蘇木往往是結合曙紅，紅色的熒光染料染色的各種細胞質結構。 這兩個污漬的結合使細胞的細胞核染色被染成紅色深藍色，并具有細胞質成分。

程序用于染色生物體組織范圍從單個細胞與染料非常簡單的混合物，以消耗大量的時間和材料復雜的多步驟的組織切片工序。 涂片通常可以通過簡單地丟棄染色和固色劑的混合物到含有細胞進行檢查培養管被污染。組織切片是更困難的，并且需要幾個固定劑和被放置在顯微鏡載玻片上，并通過染色和洗滌液的色域運行之前，切片的步驟。

大多數的污漬是可以得到自然的或在實驗室中被合成復雜的雜環有機染料。 染料的特征在于它們的紫外和可見吸收光譜，這是用來從另一個區分1污點。 一個典型的可見光吸收譜的三苯基甲烷染料堅牢綠示于圖2。 阿強吸收帶集中在620納米過濾掉大部分的紅色光波只留下綠色和藍色的。 快綠是用來選擇性地染色膠原蛋白，粘液，和植物細胞壁帶負電荷的（陰離子）染料，渲染這些結構藍綠色到深綠色。 顯然，使用有機染料著色的生物組織時，染色的吸收特性，必須加以考慮。

污垢選擇性是由染料分子相對于它們與細胞成分相互作用的化學和電子性質來確定。 具有凈正電荷的水溶液或緩沖溶液的污漬會選擇性地附著或結合到帶負電荷的生物結構。 親水性污漬將趨于弄臟水合生物組件，例如蛋白質和核酸的外部。 污漬與疏水特性將分割成的膜，脂質和蛋白質的內部。 生物組織選擇的污漬時，這些屬性應該被銘記。

常見的生物污垢以及它們的可見光吸收特性的匯編在表1中。 使用顯微鏡染色生物組織的染料具有廣泛的色彩范圍，從深藍色到明亮的紅色，用中間色也可無數。 檢查表后，將成為明顯的是，許多染料具有相似的光譜特性，并在乍看之下，這似乎是相似的染料可以互換使用染色生物標本。 在許多情況下，類似的染料可被取代的無不良影響，但在某些情況下，替代染料可在不可預見的方式，得到不理想的結果與其它染料或生物結構進行交互。 這是常見的，其中的染料的化學和物理性質，必須精細地調諧并匹配彼此復雜污垢的混合物。通常，取代基的一種染料的另一個顯著地改變了混合物的染色性能。

如上面所提到的，許多染料具有相似的顏色和光譜性能。 然而，在他們的可見吸收光譜仔細檢查，出現類似的染料往往顯著變化在它們的光吸收曲線。 作為一個例子，我們可以比較它們似乎是相同或幾乎相同的光譜特征三個紅色染料：達羅紅，番紅O和蘇丹紅IV。 對三種染料的可見光吸收光譜示于圖3。 雖然所有三種染料強烈吸收在430至580納米（藍綠色）區和發射紅色波長的光，其主要的吸收最大值高達40毫微米不同。 光譜寬度和波長吸收分布也不同遍及三個光譜。 達羅紅色的強烈吸收波長在400到460納米范圍內，但番紅O有少許吸收在這個區域。 番紅澳的吸收光譜也移動20納米朝著在580-600納米的區域更長的波長。

三種染料的電子，化學和物理性質發生變化比的吸收譜，甚至更多。 番紅O是非常易溶于水，但在其它兩種染料是僅微溶于水或緩沖溶液。 此外，達羅紅和番紅O為陽離子染料（他們有一個凈正電荷），而蘇丹IV是不帶電和中性。 通過三種染料有針對性的生物結構也各不相同。 達羅紅是專門用于含有核酸RNA和DNA，番紅?污漬核和細胞壁的組件結構，以及蘇丹IV是選擇性的脂質和存在于細胞和組織中的脂肪物質。 考慮到這些事實考慮，很明顯，這三個染料是不可互換的，并可能產生混亂，如果他們在與其他染料的混合物相互替代。

在黑色和白色顯微圖像對比度優化需要仔細調整可見光穿過樣品，并在膠片上乳液。 為了提供試樣的元素和背景之間的適當的視覺差別，兩種染料和彩色濾光片的可見光光譜特性的工作知識是至關重要的。 常見的生物污漬吸收光譜發表在各種來源，但有兩個最好的作品都是污漬，染料和指標Sigma-Aldrich公司手冊和HJ康恩的生物染色劑 。 表1包含了最常用的生物污垢和有用的可見光透過率為每個染料的光譜范圍的列表。

彩色濾光片可從玻璃支架或明膠正方形的形式專業攝影的供應商和顯微鏡制造商。 最流行 的一系列的過濾器黑白顯微攝影是柯達雷登明膠濾鏡，這是索引與一個標準的編號系統（見表2）。 這些過濾器是非常適合與大量的有機染料可用，每一個都可以被精確地標準化與染料的每單位面積的存在量臨界顯微攝影。 由其他制造商生產的過濾器可以被引用到柯達的編號系統，建立等效的過濾性能。

在雷登過濾器是由明膠薄膜混合適當的染料和投射到光學級玻璃板，然后讓其變硬。 硬化膜從玻璃板剝離，并涂有一薄層清漆的保護。 雷登過濾器很容易修剪用剪刀來允許修改放置在顯微鏡濾光片架。 雖然薄漆涂層能提供一些保護脆弱的過濾器，他們應該小心握住的角落，以避免磨損和污垢和油脂從皮膚上堆積處理。 過濾器也應受到保護，用玻璃過濾器熱，從由顯微鏡燈產生過多的熱量。 持續暴露于熱過度延長的時間期間可引起篩選褪色。 雷登過濾器可以用駝毛刷和壓縮空氣進行清潔，但不應該放置在溶劑或水，以避免腫脹直接接觸。

過濾器可以被放置在多個點在顯微鏡的光路。 許多現代顯微鏡具有定位在燈箱與底座之間的載波，將持有數的過濾器。 較舊的顯微鏡往往正好位于臺下聚光器下方的過濾器載體。 避免將明膠濾光片上的顯微鏡光端口或近共軛平面（近場光闌或試樣），以防止劃痕和其它瑕疵從被聚焦在與場光闌葉片試件的平面上的任意點。

當過濾器被添加到該光路中，膠片的曝光時間必須調整（通常是增加），由過濾器，以補償光的吸收。 每個過濾器都有一個使用該過濾器時（見表2）作為一個粗略的指南，曝光調整指定的過濾因子 。 各種條件下一起工作以影響對曝光的影響由給定的過濾器，包括該膜的光譜靈敏度，光源的顏色溫度，試樣和污垢的可見吸收光譜。

對于任何給定的過濾器的過濾因子能夠而且應該通過實驗來確定。 選擇一個標本，有一個大面積的中性灰色的背景，并采取幾個測試曝光無過濾器的地方。 這是明智的支架顯微照片整個實驗過程。 下一步，將過濾器中的光路，并作出一系列曝光，在三分之一提高到二分之一光圈為單位，通過更多地接觸兩到四站，取決于過濾器的密度。 選擇最佳的顯微照片后，比較的曝光數據，并確定從兩次曝光產生相等的密度之間的曝光時間的差的濾波系數。

因為自動攝像系統將彌補增加的密度，當過濾器被放置在光路中，通常不需要過濾因子暴露加法。 然而，在許多情況下，在光電倍增管或光電二極管可以測量入射光強度的相機光譜感光度的細微差別可能導致不正確的風險。 深色的過濾器可能會略有取代顯微鏡焦點，由于物鏡的光學特性，所以仔細添加過濾器的光路后，檢查重點。 始終目視檢查的最終顯微照片和手動執行任何必要的調整。

干涉濾光器也可以被利用，以提高在黑白顯微攝影反差。 這些過濾器使用多個蒸發薄層金屬合金的光學級玻璃制成，高度精確的相對光譜透射和吸收特性。 干涉濾光器由波長帶所發送的兩個中心和寬度指定。 它們是商業上可從光學元件供應商或從顯微鏡的制造商。

表2可以被看作是一個柱狀圖的編制較柯達雷登過濾器用于黑白攝影的傳輸特性。

可供選擇的過濾器和污漬為黑白顯微攝影的目的，在可見光光譜可分為三個主要區域，這在于在400至700納米之間的波長范圍內。 400和500納米之間的波長時，一起觀看視覺上顯示為藍色的光。 同樣地，500和600納米之間的波長呈現綠色，而這些600和700納米之間顯示為紅色。 能吸收400至500納米之間的所有波長的染料將通過僅較長的波長500和700納米（綠色和紅色光）之間，且會出現黃色，這是由混合的綠光和紅光等分得到的初級減色。 如果染料400和500納米之間的光透射和吸收光的波長較長（500至700納米），那么它會出現藍色。（本文來源：奧林巴斯顯微鏡，過濾器黑白顯微攝影）

作為一個例子，我們將研究剛果紅（見表1），具有很強的吸收區域400和560納米之間的吸收光譜。 藍燈波長400至500納米的下降是由剛果紅吸收，因為是擺在500和560納米之間的綠光波長。 560和700納米之間只有較長的波長是由染料傳遞的，所以染料出現視覺上為紅色。 甲苯胺藍和臺盼藍兩個發射藍色波長和吸收更長波長的光，然而兩種染料出現有稍微不同的色彩對人的眼睛。 這是因為臺盼藍吸收高于500納米波長的一切，而甲苯胺藍只吸收上述560納米波長的那些，并通過綠色波長的區域500和560納米之間。 因此，臺盼藍出現了深刻，豐富的藍色，而甲苯胺藍似乎在視覺上是一個藍綠色。 在普通染料的可見光吸收光譜的差異（見表1）允許顯微鏡有很大的自由度去選擇生物污漬時，選擇合適的光譜范圍。

過濾器相同的方式運作，相對于可見光的染料。 柯達數字濾波器38A發射360和570納米之間的波長，涵蓋了藍色和綠色。 類似的過濾器，柯達數39，也是一個藍色的過濾器，但傳輸或通過310和480納米之間的波長。像臺盼藍和甲苯胺藍，這兩個過濾器通過光略有不同的色調。 該傳輸所有的2光譜區域或大部分，但是阻止三分之一（例如柯達39濾波器）濾波器通常被稱為減去濾波器。 數字濾波器39有時也被稱為減藍濾光器，因為它是能夠從可見光光譜阻止或減，藍色波長的光。 以類似的方式，一個數字濾波器32顯示品紅的眼睛，并且被稱為減去綠色，因為它吸收的綠色光在500至600納米的區域。 32號過濾器在320?500和600 +納米范圍，這加在一起，產生的顏色洋紅色透射藍光和紅光。

當配置在顯微鏡對染色標本的黑白顯微攝影，可以很方便地指無論在染色中使用的染料和用于控制對比度的濾光片的可見吸收光譜。 圖4示出了一系列的過濾器用于控制與染料堿性品紅（圖4（a）），其強烈地吸收在520至570納米波段的光，并出現紅品紅到眼睛的對比度。 堿性品紅的吸收光譜表明，吸收了藍色波長在這一地區的一部分（但不是全部）460和500納米之間的肩膀。 這肩部負責輕微的紅******調出現在偏離真正的品紅色染料。

對比從沾滿堿性品紅生物標本制作顯微照片將取決于過濾器的選擇。 一種過濾器，是相輔相成的染料將吸收所有的染料發射的波長或大部分。 這種效應被認為是在圖4（b）如堿性品紅的吸收光譜和柯達數58過濾器疊加。 350和500納米和紅色波長大于600納米之間的藍光波長是由過濾器吸收，對黑白膠片拍攝，得到的顯微照片對比量最大時變暗染色區域。

當使用過濾器，其具有透射率范圍比染色的吸收區域更寬，如圖4（C）發生的污垢較少變黑。 黃色號碼12柯達濾波器，其傳輸所有可見光波長大于500納米，的吸收光譜疊加在堿性品紅頻譜如圖4（c）所示。 該過濾器的剪輯部分在450到510納米區域的染料的波長，產生的所得顯微照片對比適量。

污漬的極小變黑可以通過選擇在同一個區域吸收光的染料的濾波器來實現。 柯達47B濾波器具有一個可見吸收光譜中波長分配到堿性品紅（圖4（d））類似，并且將產生的顯微照片以比數12和58的過濾器的對比度以下。 其他污漬可以比作以微調黑白顯微攝影顯微鏡照明器以類似的方式。

比較染色/過濾器組合黑白顯微照片是理解過濾的顯微攝影的概念有幫助的。 如圖5所示，有兩個例子，其中樣品的對比度顯著，通過使用互補濾波器的增加。 圖5（a）和（b）是染色的人回腸（腸）組織未經過濾器截取的顯微照片（圖5（a））和與該吸收大部分的染料顏色的（圖5（b））的過濾器。 在這種情況下，污垢是非常淺的，并且需要一些調整，以允許所述組織可以從背景中區分。 由濾波器產生的對比度增加有助于試樣站出來對灰色背景由發黑試樣顏色而不顯著影響的背景。 在圖5的（c）和（d）的顯微照片是使用過濾器，以促進標本對比度的另一個例子。 海星睪丸的染色薄款（圖5（c））變黑（圖5（d））時，免費的過濾器被添加到顯微鏡的光路。 昏暗的污點有助于揭示細胞間結構，這些染色切片的細節，但必須在過濾器選擇的做法，以避免反差太大。

過濾器還可以用于增強對比度并在標本染色用多于一種顏色提供細節。 在圖6所示的顯微照片（a）和（b）示出的薄人肺組織患支氣管肺炎的部分。 未經過濾（圖6（a）），背景是暗并往往掩蓋重要標本細節在肺組織。 用適當的過濾（圖6（b）），背景，這是不重要的，是減輕和含有的最重要的信息的試樣的那部分變得更加明顯。 確切的數量和類型的過濾來優化這種效果，必須通過實驗來確定。

減輕污漬顏色，或以補償過染色的樣品，具有相同顏色的污垢，應插入顯微鏡光路中的過濾器。 圖6（c）示出了椴木莖感染了真菌禾柄銹菌的重染色薄切片。 色斑是這么厚的噴發膿包的細節模糊，但這個偽像在圖6（d）加入含有相同的吸收特性作為膿包濾波器補償。 在這種情況下，減輕污漬有助于降低圖像的對比度和揭示了過多污垢被掩蓋了細節。

通過使用過濾器采用對比度控制，應謹慎對待。 最終的圖像取決于雙方的適當選擇濾波器和一個判定哪些試樣的部分應調整。 反差太大可能使局勢惡化，而太少的對比結果往往缺乏足夠的細節圖像是有用的。 我們建議廣泛的實驗通過觀察濾波器到位試樣并通過比較濾波器的傳輸和污漬吸收特性。 通常，結果是可以通過將不同的過濾器入光路，直至達到最佳的對比度實現加以改進。 黑白膠片是價格相對便宜，所以測試各種過濾器通過將全色片盡可能多地獲得的結果。

柯達彩色濾光片圈（圖7）包含有關開始使用全色膠片對比度調節點的信息。 選擇彩色濾光片時，以提高樣本的對比度和背景區分重要的細節，此圖應作為指導。 因為染色的顏色和其可見吸收光譜有很大的不同，最終的過濾器的選擇將取決于樣品和污漬或污垢的混合物時。 全色感光乳劑，會有不同的反應，以紅，綠，藍三種光，并應記錄重要數據之前進行徹底的測試。 在一般情況下，一個黃綠色濾光器，如柯達號碼11，應使用以建立正確的灰度色調乘法染色標本。 當使用日光照明（氙氣燈或光閃光管），插入一個黃色8號過濾器，以補償這種色溫較高比例的藍色光存在的。 有些全色薄膜具有高靈敏度的紅色，應該用13號濾波器鎢鹵素燈照明或11號過濾器日光照明使用。 應當提到，這些過濾器是專門用于黑白顯微攝影，并不能與彩色膠片使用。在表3中列出的濾波器的建議提供在選擇過濾器的對比度增強的起點。

偶爾，防污組合抗蝕劑的嘗試，以產生樣品的細節和背景之間的足夠的對比度。 這發生在兩個污物的顏色也有類似的亮度值和過濾器是用來調整顯微鏡的照明色溫為黑白電影。 固化是要找到一個過濾器，將吸收的一種顏色幾乎完全而部分吸收了其他顏色，這樣既將有與背景對比度好。

因為生物染色劑的顏色可以根據試樣而異，但并不總是可能推薦一個特定的過濾器，即使當在染料的光譜特性是已知的。 考慮一個青紫色斑狀結晶紫，發送兩個紅色和藍色波長。 使用Kodak雷登23A淺紅濾波器與該染料將允許一些紅色波長的要被發送的，但過濾器將不能完全消除顏色從染料。 類似的結果可以得到其它常見紅色濾光片包括雷登數字24，25，和26。 然而，所有的常見的紅色過濾器將徹底從一個純粹的藍色染料如甲苯胺藍吸收波長。 萬一結晶紫，深綠色濾光片（雷登編號58）可能是用于對比度增強的最佳選擇。 添加一個過濾器，光路后，一定要檢查繼續進行顯微攝影之前，通過目鏡觀察樣品對比。

除了對比度控制，過濾器可以被用來克服光學象差，提高圖像的分辨率。 顯微鏡物鏡不同樣良好地校正光學象差，在整個可見光光譜。 在黑色和白色顯微攝影，過濾器可以被用來利用光譜那里的物鏡具有最佳性能的那一部分，從而提供最佳的圖像質量。 消色差物鏡是在光譜的波長約550納米為中心的綠色部分校正光。 在顯微鏡的照明可以通過增加綠色濾波器具有窄帶寬的光路徑（之前的樣品）取本校正因子的優點進行調整。柯達雷登濾波器數字58，61或99可用于顯微鏡光的帶寬限制在500-600納米區域，以便使用消色差物鏡時優化顯微攝影。 的帶寬可以進一步通過加入黃濾光（柯達數字15或類似的）的限制。 螢石和復消色差的物鏡是更好的色差修正，不會大幅從黑白單色顯微攝影照明中受益。

過濾器還可以幫助產生適度增加分辨率時照明的帶寬只利用最短的可見光波長，它趴在380-400納米的區域。另外一個柯達數字47B藍色濾光片在顯微鏡光路的波長限制傳遞到標本的400和470納米之間。 在光學顯微鏡，點至點的分辨率是根據下式計算：

其中，R是兩個結構元件之間的最小可分辨距離，λ是照明光的波長，NA是物鏡的數值孔徑。 從這個等式中，很明顯，分辨率是成正比的光的波長。 更短的波長導致較低的R值，從而以更高的分辨率。 使用這個公式，可以計算出該數值孔徑等于0.9的一個目的，分辨率將是0.39微米，對于紅光（700納米），0.31微米為綠光（550納米），和0.22微米為藍光（400納米）。 因此，為了達到最大的分辨率，而不管光學矯正為目的的程度，該顯微鏡還可以添加藍色濾光片的顯微鏡光路中。

在圖8中呈現的顯微照片示出了分辨率增強的使用帶有過濾器的黑白顯微攝影產生單色光的影響。 壓縮盤的表面上的微型護堤采用柯達技術潘膠片拍攝和100倍的平場消色差的反射光與武警在3200K色溫。左邊的顯微照片（圖8（a））是鎢 - 鹵素照明操作在不過濾從照明源只利用白光。 在右側（如圖8（b））是具有柯達數字47B插入到光路徑（藍色）濾光器制成的顯微照片。 注意護堤的增加的清晰度和銳度時由濾光器透射的藍色光照明。

過濾器的黑白顯微攝影可以是一樣重要，因為那些需要在顯微攝影的色彩正確的色彩還原。 當執行與黑白膠片關鍵工作，時刻關注乳液的特性（它們發布在網絡上，或陪膜包裝），并把它們作為起點的過濾器選擇指南。 通過仔細地選擇合適的彩色濾光片的黑白顯微攝影，任何顯微鏡可以產生呈現足夠的對比度和顯示有關標本的重要細節出色的黑白圖像。