尼康顯微鏡數碼影像色彩平衡

 在光學顯微鏡采集準確的色彩平衡的影像都可以甚至經驗豐富的顯微鏡，不管他們是否采用傳統的感光膠片乳劑或較新的固態數字相機系統的挑戰。電子圖像捕捉技術的運用依賴于同一個熟悉的屬性的光一樣傳統的基于膠片的顯微攝影，但執行白平衡調整色彩平衡的能力是電子圖像傳感器的**功能，是不是所有直觀地尋求調查從顯微鏡捕獲的數字圖像。

當拍攝的數字圖像看房相比，通過顯微鏡目鏡觀察，或在計算機顯示器上實時觀看圖像，色彩變化往往是相當***的，并試圖調和兩者之間的差異，可令人沮喪。 一個因素造成這種差異是，在成像過程中，發生在成像條件相當的住宿人的視覺系統對變化下意識的，并且通常沒有意識到，直到圖像被記錄和靜態版本進行評估，通常在彩色再現的問題不同的觀看環境。

示于圖1是一系列視場在不同的照明色溫度條件記錄在相同的顯微鏡的數字圖像。 試樣是在比較低的（二十分之一波長的）偏差相位差觀察在微分干涉對比（DIC）的粘附印度麂鹿皮膚成纖維細胞的單層培養物。 在目鏡中，細胞培養中出現的顏色中性灰色時諾馬斯基棱鏡被調整，以實現圖1所示的光程差，以及顏色轉換濾光器被添加到光路徑，以提高鹵鎢燈的色溫燈從3200K到5500K左右（日光值）。

未經色彩轉換過濾器，DIC樣品在圖1中出現的中性灰色，但表現出明顯的全局黃******調，白熾燈照明的特性，當通過顯微鏡目鏡觀察。 如果數碼相機的白平衡功能沒有被激活，并且施加到電流鏡配置，在這些條件下拍攝的圖像也出現有一個整體黃色的（圖1（a））。 插入一個彩色轉換濾光器插入光通路呈現的圖像與目鏡輕微藍色調，和相應未經白平衡校正拍攝的數字圖像保持或放大該顏色偏移（圖1（c））。 應用白平衡算法來無論是與鎢或日光平衡照明拍攝的圖像消除陰影，由于色溫度的影響，如圖1（b）所示。 注意，不同的顏色校正的值由算法來平衡圖像的色調的質量，取決于照明的色溫。 鎢絲燈照明需要修正值增加藍色和減少紅色，而相反是真實的日光照明。

實現在與耦合到光學顯微鏡數碼照相機系統獲得的圖像適當的色彩平衡取決于多種因素，首先是建立正確的照明條件和精確顯微鏡光學對準，并*終在圖像捕獲階段。 在獲得所希望的圖像的白平衡調節中的作用是特別重要的，而這種控制功能可以用于任何捕獲的樣品的*忠實再現，或試樣的目的是糾正不必要的色偏通過生成一個故意修改的表示編制文物。

從概念上講，在白平衡粗調整是必需的，使圖像傳感器的響應到適當的范圍內為一般照明的條件（類似于選擇一個類別的電影），而細微的修改是有點類似于在電影中使用的色彩補償濾鏡基于攝影。 照射源和檢測器響應的匹配，即使，光通過顯微鏡通常被修改，有些不可預測的，通過在光路中的檢體和任何其它部件。 因此，得到的*終圖像可以從所希望的結果的色彩平衡而變化。 這是極為重要的要明白，不同的試樣，和一個試樣或許局部區域，施加于成象光的**效果。 因此，如果需要精確的色彩平衡，變量諸如白平衡調整，必須仔細控制。

的色彩平衡圖像一般概念

在光學顯微鏡圖像的形成是根據光的基本特性，包括強度和產生的視覺感知的顏色，以及相關的色溫度值的光譜特性。 色溫的特性可以精確地定義為與一個標準的參考光源，并且是可衡量的工具性，但是不可靠的預測如何每個樣品將在一個給定的成像情況進行渲染。 此外，具有相同色溫的光源，可具有顯著不同的光譜組成和同樣的條件下觀察時，產生顯著不同的圖像。 除了這種情況的影響差異很大的反差增強輔助組件可以引入到顯微鏡的光學系統。 明場，暗場，相襯，DIC，偏光，霍夫曼調制對比度和熒光照明所有在場的不同表現色彩平衡校正，必須經常考慮在個人基礎上的樣品和光照條件加以解決。

呈現在圖2中不同的照明色溫和對比度增強方法的條件下拍攝的幾個數字圖像。 人類睪丸癌（精原細胞瘤）的鎢 - 鹵素照明的曙紅和蘇木精染色薄切片示于圖2（a）所示。 注意整體偏黃彌漫整個圖像時相比，正確的色彩平衡的圖像（圖7（b）所示），使染色部分折色。 這是發生在明場顯微術時，日光色轉換濾光器沒有被插入到光路徑中的常見錯誤。 另外，藍色的日光過濾器，而無需校正的數字照相機的白平衡的光路可能會導致整體偏藍的色調為數字圖像，如圖2（b）所示。 在單層培養活HeLa細胞的這種形象揭示了當相機不能正確色彩平衡所發生的偏藍。 應用白平衡算法來捕獲軟件將渲染的圖像中在顯微鏡的目鏡中觀察到的灰度值。

與其它對比增強技術獲得的圖像產生類似的問題，當顯微鏡照明的日光的色溫不均衡和照相機系統不具有的白平衡調整正確。 在圖2（c），2（d）和2（e）所示，用微分干涉對比（DIC），偏振光，霍夫曼調制對比捕獲的圖像，分別都已經色彩平衡值移位到較暖（黃色）的色調。 在DIC圖像（圖2（c）），功能出現渾濁和正常的灰階色調以棕色和紅色的各種色調渲染。 同樣，重結晶尿素的偏振光圖像（圖2（d））也出現綠色，而放射的霍夫曼調制對比度的圖像（圖2（e））具有決定性的綠色背景（和亮點）。 熒光圖像（圖2（f）），通常不會從色彩平衡問題受到影響，主要是因為它們是由一個小的波長范圍內占主導地位。

變化的色彩平衡或彩色再現的現象是公由大多數人在日常活動中確認，通常被接受為天然發生不需要任何干預。 例如，近黃昏日光的黃金質量是非常熟悉的，因為是顏色，而不是熒光燈的辦公室照明出現截然不同的燭光中的事實。 人類視覺系統的功能由眼睛的感官反應與由大腦解釋的信號組合，以適應變化的光的顏色和強度。 其結果，白色物體被解釋為白色廣泛變化的照明條件下進行。 通常情況下，如果白色被認為正確，其他顏色和色調落入地方為好。與此相反，圖像傳感器，傳統的膠片或現代數碼相機是否產生對照明的響應被固定在曝光的時刻。 所產生的圖像的顏色質量取決于設計成片彩色感光層，或固態傳感器的各個顏色感測元件（像素）的靈敏度的具體響應。 與任一捕獲方法，該圖像的顏色平衡可通過引入彩色濾光片修改成的照明或成像光的路徑，但該數字方法具有使傳感器響應的電子，精密調整的鮮明額外的優勢。

數碼相機白平衡基礎

來記錄圖像，不論是傳統的照相膠片或數碼成像裝置，通常被設計或調節，使得它的基線響應匹配照明的廣泛的一般類別的傳感器。 照相膠片，例如，*常用的有兩種主要類別，適合于在任一日光或與鎢的照明光源使用制造，并且精細的調整，以膜反應為關鍵應用是通過使用適當的過濾器進行。 固態傳感器，這是典型的電荷耦合器件（CCD）或互補金屬氧化物半導體（CMOS）光電二極管檢測器，能夠被調整的電子以匹配他們的響應特性，以各種照明源。

CCD的單個光感測元件或CMOS檢測器是固有的單色，要么通過依次傳遞入射光通過紅色，綠色和藍色濾光器到整個傳感器（產生對每個顏色，它們隨后合并分離的圖像實現其色靈敏度），或通過被放置在一個鑲嵌圖案在陣列的每個像素的微型聚合物薄膜過濾器。 *常見的過濾器裝置是紅色，綠色和藍色的彩色濾光片的排列拼接陣列，重復整個傳感器陣列的GRGB圖案。 這樣的安排，稱為拜耳過濾模式（參見圖3（a）），集成了兩倍多的綠色元素，紅色或藍色。 額外的綠傳感器的像素允許成像設備更接近人類視覺系統，其特征峰在靈敏度在綠色光譜區的顏色反應（約550納米的波長;圖3（b）），因此，方便了輸出具有目視可接受的色彩平衡的影像。 來自傳感器陣列的對應像素（或單色圖像）的單獨的紅色，綠色和藍色信號幅度的調整是通過白平衡控制功能實現的，以允許所獲取的圖像的色彩平衡。 一些相機系統通過軟件來代替或附加于硬件控制執行這些調整。

用于通用應用的數碼相機所熟悉的許多顯微鏡和正越來越多地適于連接到顯微鏡作為一種經濟的替代致力于研究級的成像系統，雖然他們的能力通常較為有限。 由于涉及在利用數碼相機進行常規用途的技術可擴展到理解的因素，例如在顯微鏡應用白平衡調節，它*初考慮的非技術的情況是有用的。 支配白平衡調整的基本概念是相同的一般的拍照應用和成像顯微鏡。

常規的數字相機通常向用戶提供許多不同的白平衡設置是可選的為“預設”。 這些可對應廣泛的照明類，如白天（晴天或陰天條件下），鎢絲燈，熒光燈，或其他各種照明場景。 很多相機都允許預設值進行微調，以達到圖像更精確的色彩平衡。 一些攝像機具有附加功能通過參考一個白色卡片上，墻上，或者如果包括在圖像中應表示為白色另一個目的是調整白平衡。 在實踐中，攝像機的位置，使白色物體充滿視場，以及白平衡調整是由開關設定或在操作菜單（取決于特定的相機）選擇啟動后，該相機進行適當的傳感器的調整渲染目標為白色。

參照定義的白色物體調整收購圖像時使用的，并能提供高度精確的色彩平衡校正相同的光照條件下進行的。 該過程必須然而，應當光照變化重復。 高級攝影師往往會選擇通過使用比那些匹配的照明，以達到理想的美學效果等白平衡設置來修改自己的形象。 例如，圖像可出現比它如果獲得了“正確的”白平衡色調較冷或較溫暖。 這樣的效果，當然，考慮錯誤，如果準確的現場演繹的用意，類似于鎢絲燈照明采用日光平衡片，反之亦然。

色彩平衡，這一般應避免在關鍵應用的流行的技術，通常是指在消費相機的自動白平衡調整。 此方法的目的是要施加到所述圖像場作為圖像獲取和功能通過評估的視圖的整體字段均存在相對于色調的光值，以及試圖進行平均，或零輸出，任何整體顏色偏。 自動平衡技術的缺點是存在于任何視場的顏色值表示一個“平均”分配的色調，這相結合，產生中性灰色或白色。實際上，如果總的像素響應不相似的編程（預期）整體平均，白平衡調整相機發出不會產生準確的色彩再現。

在顯微鏡下觀察到的典型標本有很大的不同顏色分布，往往表現出單一的主色調（尤其是在熒光）。 這很可能是一個自動白平衡調整的試樣表現出主要是紅組織染色將產生比施加到藍染色的制備相同的過程實質上不同的色彩平衡進行。 既不是可能導致一個準確的樣品表示。 試圖通過相機電路以平衡檢測器的響應輸出一個整體的平均顏色值將在不同的樣本產生非常不同的結果，特別是如果一個給定的視場具有很強的或主導的色彩。 還有，當然，為產生具有自動白平衡（*有可能的那些的白色或灰色的區域很大比例）可以接受的結果的標本的例子，但該技術缺乏必要使其常規有用的重現性。

在顯微鏡白平衡調整

在考慮用于優化白平衡討論了不同的方法，這是明顯的，有些技術不適合自己以光學顯微鏡的約束和要求。 對于特定類型的照明，利用預先設定的值，假定光源的特性是固定的，有顏色的溫度和其他光譜質量的標準值。 當鎢鹵燈被采用，它是在顯微鏡通常的做法是改變燈電壓來控制光的強度或減少熱量的產生。 這樣產生的照明色溫度，這會導致不正確的色彩平衡，如果鎢型照明的標準的預設值被用于在數碼相機上的變化。 色彩還原變化的另一種原因從發生在彩色輸出作為其使用壽命期間燈具時代的變化。

與那些*佳的日光（約5500K）色溫區域平衡的光源也存在類似的問題。 不僅是“日光”變量的色溫，但很少有人工光源準確地模擬日光的光譜特性。 這些困難可能，在理論上，可以至少部分地通過允許自動電路來校正次要照明波動克服，但是其他的問題往往使這種方法不可取。與像場的自動評估的，局部的試樣的變化可以在彩色平衡產生重大誤差。 在一般情況下，對于大多數顯微鏡應用，*好的辦法是限制白平衡評價一個精心選擇的圖像區域或其他合適的物鏡。

當數字捕獲設備是利用圖像的顏色樣本在光學顯微鏡，獲得正確的色彩平衡，以提供樣品的真實再現通常是首要物鏡。 從這個戰略意圖的偏差通常只取得了糾正與產生不良偏色的樣品制備問題。 *科學級數碼相機，包括那些專門為顯微鏡設計，依靠參考調整白平衡，以選定的顏色值。 在透射照明，適當的區域（通常為白色或中性灰色的）被選為從試樣字段或單獨的照明場中進行調整，以從光路取出的試樣。 為了在利用反射光顯微鏡進行白平衡調整，白色或中性灰色卡（或紙部分）可以被定位于代替試樣的顯微鏡載物臺上。 白平衡設置是通過測量從白卡的表面反射的光隨后獲得。

大多數設計為顯微鏡通過駐留在主機計算機上的軟件控制和數碼相機通常被配置為與多個顯微鏡的功能進行交互。 為尼康DXM 1200數碼相機系統的軟件接口，例如，具有代表性的現有相對于在該白平衡調整的實現方式的商業產品。 當白平衡調整窗口是用戶界面中的啟動時，選項供由攝像機系統中選擇的視場區域的白平衡的評價。 在顯示屏上的實時圖像，應仔細評估一個合適的白色或中性灰色地帶，作為圖像傳感器的參考點。 如果顯示在監視器具有色偏不同于在顯微鏡的目鏡中觀察到的色彩平衡的圖像，照相機系統必須進行白平衡，以使該試樣的準確的圖像進行調整。 理想情況下，所顯示的偏色將由當正常試樣區域被選擇為白平衡調整攝像機的彩色平衡電路被刪除。

可以被用來設置數碼相機白平衡算法標本領域幾個典型的例子示于圖4。 該標本是成纖維細胞的生活文化影像與微分干涉對比（圖4（a）），淀粉顆粒馬鈴薯組織在四染色薄款在光照下（圖4（b）），與人類紅細胞相位對比（圖4（c））。 每幅圖像上，適合在使用區域選擇技術白平衡調節的區域中的紅色概述，而黃色箭頭表示上選擇一個像素時，可能會產生滿意的白平衡校準圖像的特定點。

所選擇的作為白平衡參考區域應盡可能大，且無試樣漬的著色效果，流鼻血到安裝介質。 在許多系統中的白平衡調整軟件能夠把一個單點（像素）的圖像中，或者可以由選取框用鼠標光標指定更大的區域選擇。 更好的結果是通過選擇盡可能大的區域獲得的。 在結果中更廣泛的變化可能發生，如果被選擇用于調整單個點，因為波動的紅色，綠色和藍色的像素強度局部組合可以向白色的整體視覺效果。 通過選擇一個較大的面積，平均獲得在傳感器陣列中的一個更大數量的像素，以實現可接受的色彩平衡的改進的可能性。 以下參照區域的選擇，白平衡調整被啟動，并且相機系統利用任一種算法或查找表（LUT）來設置適當的電子值（例如傳感器增益為每個分量的顏色）產生一個中性或白色的顏色值。

如前面所討論的，數字圖像的顏色平衡是通過由CCD或CMOS圖像傳感器收集的波長的光譜的嚴重影響，無論該傳感器是否被容納在一個照相機，望遠鏡，激光工作臺，或顯微鏡。 在采用這些固態器件彩色數碼相機，一系列的平衡調整，通常是必要的，以便產生符合上述照明光源的顏色溫度可接受的彩色影像。 成功地實現正確的色彩平衡若干準則應考慮：

• CCD圖像傳感器對紅外光敏感的，并且是*可靠的性能對可見光成像只能過濾掉波長較長的紅外線來實現。 一些系統可裝有紅外線阻擋元件在照相機內，但如果這被確定為不是這樣的話，適當的過濾應該被添加到排除這些波長在到達圖像傳感器之前。

• 對于其中的白平衡調整被檢體圖像，空白樣品載玻片，或反射光的參考（例如，白色表面）上進行任何配置顯微鏡，顯微鏡應具有光學系統對準的正確科勒照明和準確地聚焦在樣品平面中。 確保這些條件*大程度地減少從色差所造成的視場照度不均勻或顏色異常的問題。

• 通常，圖像傳感器的性能是*佳的色溫較高的區域，這就要求鎢 - 鹵素發光器可以在所建議的電壓調節范圍的上端操作為數字成像。 任何必要的減少照度應始終與中性密度過濾器，而不是通過降低電壓來照射燈進行。 同樣，適當的色彩平衡是*容易實現與數碼相機，如果一般用于攝影的日光平衡彩色膠片的色彩平衡濾波器插入照明光路。 尼康稱此濾波器作為南商 （中性色彩平衡），雖然其他廠商有不同的名稱具有相同用途的過濾器。

• 白平衡的中性灰區域中的樣本現場調整可能會產生更精確的結果比如果一個非常亮的區域被選為白色參考。 是完全的區域“泛白”，或*出傳感器的動態范圍，可以由一個或多個組件（RGB）的顏色出現白色的圖像中作為過飽和度的結果。 獲得的色彩平衡電路對這樣一個區域進行補償可能產生不準確或不重復的結果。 灰色區域（具有中性密度）是由紅色，綠色和藍色像素傳感器（或單獨的RGB彩色圖像）約等于信號電平產生。 作為一個結果，基于中性區域精確的色彩平衡更容易實現。

• 多個變量影響的顯微鏡獲得的圖像的色彩平衡，以及它們的相互關系的理解是在實現可接受的結果很重要。 通過成像軟件界面進行曝光設定，由圖像傳感器電路的增益調整進行。 因為白平衡的調整是通過RGB傳感器的選擇性增益補償也生效，曝光量應設置為一個近似正確的價值開始白平衡調整之前。 如果曝光時間被改變，或其他更改增益和偏移都需要經過白平衡矯正已定，*好是重復的白色平衡調整步驟，因為所有這些因素彼此互動。 同樣地，向顯微鏡，影響光的屬性，如隔膜的調整，更換過濾器，以及切換目標組分的變化，可改變白平衡和要求，以便再次進行校正，以獲得*精確的圖像。

• 如果一個特定的應用程序需要作出關鍵的顏色判斷或1樣品和另一個選定的一組（其中，標本已按照標準程序制備）內進行比較，它不重復的白平衡調整每個樣品是重要的。 在這種情況下，*好的方法是執行對單獨的照明初始白平衡校準（在這里的空白顯微鏡載玻片），然后獲得一個樣本的圖像，使任何必要的曝光調整。 再次替換空白幻燈片的標本后，白平衡日常應反復在照明領域，而不進行任何更改曝光或顯微鏡配置。 被比較的標本應接著在白平衡，曝光，等等相同的設置進行成像。 如果暴露的變化是必需的，他們應該保持在*低限度，以避免影響色彩平衡。 重述在這種類型的應用（其中彩色再現正在其中試樣用于測試或診斷目的比較）的關鍵概念，白平衡調整應該在單獨而不是為每個試樣校正的光源來進行。 因此，比較有可能對于每個樣本賦予顯微鏡照明光源的色彩效果。

• 在調整的數字化采集系統的白平衡光學顯微鏡目前更多的挑戰所采用的某些照明和對比度增強技術。 偏振光，暗場和熒光方法通常存在寬視場其中標本呈現在深度飽和的色彩在深色背景，以白色很少或沒有的地方。 有些攝像機系統提供了一種機制來設置暗平衡或黑平衡這種類型的成像情況，其中沒有合適的白色或中性灰色區域是可用的。 這種方法就建立了傳感器響應一個基準確定，并且可以提供滿意的色彩平衡。

• 對于暗背景樣本的圖像的替代方法是用試樣上除去照明場進行白平衡調整。 對于高度飽和的，深色的標本，但是，適當的曝光成像可能需要極其明亮的照明或相對較高的相機增益設置。 這可能會限制白平衡調節的準確性，如果這是在不存在試樣上的明亮的照明場進行。 為了讓白平衡電路，以評估該照明在類似于與試樣現有（和在近似正確的曝光設置）的亮度級，中性密度濾光器可以在白平衡調節被插入到光路中，并且然后與試樣實際成像取代。 一些實驗是必需的，以便選擇近似于試樣的傳輸特性文件的中性密度濾光器。

白平衡操作

情況經常遇到在可接受的白平衡不能圖像拍攝過程中按照一般的協議來實現的。 在這些情況下，非標準技術有時可以采用能有效地“欺騙”攝像機的白平衡功能，以產生特定顏色的平衡，這可能會或可能不會被認為是正確的，但達到了預期的效果。 如果連這個策略不能提供可接受的色彩還原，或者如果現有的圖像，與差的色彩平衡，采集后圖像處理與數字圖像編輯軟件（如Adobe Photoshop）初始取得可以提供一定程度的修正。

為了應用上述技術，各種濾色器通常用于透射光的配置是有用的。 設計用于彩色照相印濾波器組是適合于此目的。 該套包含一系列在各原色的密度，并且可以被組合以產生任何所需的色調。 為反射光顯微鏡，適于反射色的引用是必需的非白色平衡。 這是沒有必要的目標符合任何顏色標準，和實驗通常是必需的，以產生所需的結果。 任何有色反射面可以使用，但*好是有一個可用的寬范圍的色調和飽和度的變化。 服務到家中心或油漆店油漆色樣卡是理想的目的，因為它們是在幾乎每一個可以想象的顏色變化提供。 在某些情況下，試樣本身的選定區域可以被用來設置斷色的白平衡校準。

無論是利用過濾器在反射光透射光或反射物鏡（如油漆樣卡），操作相機的白平衡功能的概念是相同的：在非白色的白平衡校準會導致相機的電路，以消除物鏡顏色，并使其作為一個較為中性的灰******調。在大多數情況下，只有一個微妙的變化是需要的，并且試驗將確定目標的色調和飽和度，將產生整個圖像的平衡，使必要的改變。平衡在一個淡藍色的顏色會導致整體變暖的影響，或轉向紅色。相反，采用淡紅色作為參考會產生偏藍轉向涼爽的色彩平衡。其他顏色校正遵循相同的一般邏輯。在任何給定的顏色進行白平衡將傾向于導致相機的電路，以移位的色彩平衡朝向互補色。需要強調的是，這些非傳統的彩色平衡技術對于實現所希望的結果時，通常的方法都失敗了（用于與特定的樣品制備，光源，或成像裝置的原因）的潛在機制是重要的。在這種情況下，它仍然可能通過抵消相機的響應標本調色板獲得可接受的圖像。

總之，缺乏顯微鏡照明光源和膠片乳劑或圖像傳感器校準之間的正常色溫的平衡是*常見的原因，在顯微攝影和數字成像意想不到的顏色變化。如果光源的顏色溫度太低的膜或傳感器特性，導致顯微照片和數字圖像將有一個整體的黃色或偏紅，并會出現暖。另一方面，當光源的顏色溫度過高時，產生的圖像將具有一個藍色的演員，并會出現冷卻。錯配的程度，將決定這些顏色的變化程度，以導致極端的顏色變化很大的差異。相同的效應發生與固態的數碼相機系統。由于有問題的，因為這些顏色的變化可能看起來，他們總是容易被正確使用的轉換和光均衡器的校正，或用數碼相機的白平衡電路的正確校準。