徠卡顯微鏡，干式超薄切片與上高凝壓力
骨礦化的細胞培養模型：UMR106-01細胞更快地做到這一點，在時間上同步，并產生更多的礦物
我們已經使用培養UMR106-01成骨細胞，調查骨礦化的過程。 UMR106-01細胞以及初級顱蓋骨細胞球形聚集胞外*分子蛋白質 - 類脂復合體，稱為生物礦化灶（BMF），其中的羥基磷灰石礦物所述*晶體沉積（Midura等，2004;。Wang等， 2004）。 這些文化模式之間的主要區別是與礦化發生時，從12-16天電鍍初級成骨細胞88 h代表UMR106-01細胞后不等的速度。
如果礦化是阻止磷源或通過添加絲氨酸蛋白酶抑制劑AEBSF遺漏，BMF復合物形成，但沒有發生礦化。 有趣的是，*結構的研究表明，對礦化BMF事先含有大量膜囊泡有限大小不等，從50納米到2微米的直徑。 然而，*礦物晶體未檢測到UMR106-01細胞鋪板后78小時和球形站點推定為小泡內被本地化。
具體地，共焦拉曼光譜的分析顯示內BMF礦化是在一個培養瓶（Wang等，2009）中的所有的BMF同時發生一個漸進的，多步驟的過程。 重要的是，幾種蛋白質譜的變化是檢測每個BMF內前低結晶羥基磷灰石的沉積和礦化時被攔截，這些變化并沒有出現。 因此，在BMF礦化是一個時間上的同步過程。 然而，了解礦化的生化機制需要的鈣，磷離子處理前之BMF晶核的詳細升值。
鈣，磷以及目前的水溶解度的方法排除在生物礦化初始水泡事件的*微結構分析？
以前的工作已提出，軟骨和/或骨礦化利用一個單一囊泡群體富集鈣和磷，或，2囊泡種群分別富含鈣或磷（圖1）（安德森，1967;博努奇，1967;阿瑟諾和Ottensmeyer，1984）。 為了弄清這個問題，這些離子的溶解性就必須使用其他方法如高壓冷凍和冷凍置換，以避免損失標本固定期間，嵌入和切片。 因為大多數現有的研究還沒有一致的檢體處理過程中避免水，偽非水性處理的成骨細胞介導的礦化過程的真實影響是難以評估。
本研究的目的是使用同步UMR106-01培養模型，以緊接音響RST羥基磷灰石晶體的成核設計和驗證一個偽非水處理方法，圖像內的BMF鈣，磷離子的分布在其中（圖1） 。 我們認為此方法也應適用于在其他細胞如肌肉鈣離子的分布隨時間變化的調查。
圖。 1：外礦的單，雙泡模型。 上游面板，單基質小泡模型。 鈣，磷離子通過的Ca +2-ATPase的抽， 鈉 ，磷共轉運和磷酸酶作用于磷脂建議的行動逐步集中基質小泡的單一種群內。 一旦鈣2和磷酸根離子到達一個閾值濃度（黃色），初始礦物晶體的成核發生導致囊泡和結晶，可以在周圍的細胞外膠原基質內傳播額外晶體釋放的破損。 較低的面板，雙泡模型。 鈣，磷正逐步集中囊泡的生化顯示不同的功能分布，包括鈣離子泵ATP酶和Na+-磷酸共轉運活動，分別為兩個不同的種群內。 隨后，這些鈣，磷富集囊泡種群融合和核礦物晶體導致囊泡和結晶，可以在周圍的細胞外膠原基質內傳播額外晶體釋放的破損。
鈣，磷是由高壓冷凍，冷凍或取代傳統的固定樣本丟失
使用高壓冷凍和冷凍置換不足以留住不穩定鈣磷礦化成骨細胞培養物中
鈣，磷可以從樣品要么在高壓冷凍和冷凍置換或傳統固定過程中丟失。 評估我們的偽非水方法的有效性，我們選擇了停止的文化在76小時，12小時添加β-磷酸甘油礦化刺激后，但在此之前2小時礦物內BMF（Midura*晶體的外觀等，2004; Wang等，2009）。 某些文化中，隨機選擇用于常規固定（圖2）進行處理而另一些則通過高壓冷凍機（Leica EM PACT）處理，冷凍干燥，取代（圖3）。 這些成對的文化比較支持幾個結論。 大面積的含有常規的固定后稍微均勻的顆粒有機基質中。 這些區域似乎從它們的體積排除膜囊泡有限。 與此相反，高壓冷凍培養物含有大量的幾乎“白”胞外區，大約0.5-1微米的直徑，內BMF（箭頭，圖3）。
在較高功率的觀點，這是顯而易見的，盡管低對比度這些“白”的區域不具有一個基本的細節表示一個范圍不規則形狀的球狀體在約50至800納米的直徑（未示出）。 然而，這些“白色”區域的存在提出了關于無機或有機物質的損失迫切關注。 特別是，當與從成對的，以往固定培養物（圖2）相似的BMF區域相比，我們推測，“白”點表示它被優先地由高壓冷凍保留，但其中在進一步處理，其后丟失材料。
圖。 2：BMF的常規化學固定和濕切片后礦化成骨細胞培養外觀。 UMR106-01細胞中的β-甘油磷酸的存在下培養12小時。 箭頭限定的胞外BMF的富集稍微均勻的顆粒有機基質的輪廓。
圖。 3：高壓冷凍，冷凍干燥，取代的成骨細胞培養物含有的BMF具有半透明的斑點（箭頭所示），這些不良的對比細胞外基質的區域。 當與進行干燥切片類似的樣品相比，透光性斑點出現黑（參見圖4）。
鈣，磷潴留在干燥的切片高壓凍結，凍結取代的培養提高
并排側比較顯示干切片與高壓冷凍和冷凍置換組合須于成骨礦化文化觀察富含鈣外囊泡人口和磷
值得注意的是，隨后的電子光譜的鈣，磷成像是不可能在任一常規固定，也不該被切開的水無論標本是否后染色或不凍結取代的樣品（結果未顯示）。 因此，我們取代干切片用于高壓凍結，凍結取代文化濕切片。 鈣，磷潴留在干燥的切片高壓凍結，凍結取代的培養提高。 很顯然，干切片的取代導致生物礦化灶內的顯著增加在保持鈣和磷[比較圖3（濕切片）和4（干切片）。
從而出現如圖3的“白”點后，濕切片焦點0.5-1微米直徑的區域，現在的零能量損失圖像變暗（圖4A）。 這UMR106-01文化礦化可重復的，時間上同步的方式其實有利于這些直接比較不同文化之間（Wang等，2009）。此外，電子光譜成像表明，暗區出現富含鈣，磷（比較圖4A，B和C）。 *后，如圖所示，在圖4D中，鈣（紅色）和磷（綠）信號的疊加圖像在很大程度上相互重疊的76 II培養物如由黃色的存在。 因為其他的研究表明，76 II UMR106-01文化不包含檢測礦物晶體（霍夫曼等人，2007; Wang等，2009），鈣，磷在這里觀察到的豐富內容可以代表無定形磷酸鈣（Driessens等人，1978）和/或磷的活性有機形式，例如多磷酸鹽（Omelon等人，2009）。
圖4：偽非水性處理后，礦化BMF富集鈣和磷。 細胞在相同生長到那些在圖2和圖3。 答：零能量損失的形象描繪黑暗的出現囊泡。 B：電子光譜鈣信號的成像。 C：電子光譜磷成像。 D：在A-C的意見疊加圖像。
重要的是，對鈣，磷的礦化富集觀察重點內容的功能作用是通過非礦化控制文化分析的支持。 當類似的高壓冷凍，冷凍置換，并干燥切片方法被應用到非礦化UMR106-01培養，很少暗（鈣和/或磷富集）囊泡或顆粒進行檢測（未示出）。 *后，一個附加的優點為使用的擺動刀是它切片過程中降低壓縮和減壓的所得部分起皺。
總結
總之，我們的結果表明，高壓冷凍和偽非水性處理是必需的，以檢測早期鈣，磷富集礦化成骨細胞培養物的細胞外位點。 使用干切片的證明是鈣，磷的保存的關鍵一步。 此外，電子光譜成像表明胞外生物礦化灶內深染的囊泡之前的結晶礦物的檢測（Wang等，2009）富含鈣和磷。 現在，我們計劃使用這種方法來確定是否成骨細胞在體外和體內利用單或雙泡成礦機理（戈爾斯基科等，2004;。Midura等，2009）。