徠卡顯微鏡，超高分辨率顯微鏡提供了新的洞察核孔復合體組織
在核孔復合體（NPC）是一個大的蛋白質復合物在核膜，占本門的真核基因構成。這種復雜的包含數百蛋白質的形成為注定要進入或離開細胞核化合物的選擇性門。
正因為如此出色的功能的全國人大結構的極大興趣。到目前為止，全國人大結構分析已主要限于結晶研究或電子顯微鏡（EM）。單個組件的一些結構已經被破譯了晶體。然而，組織的復雜內部個別蛋白質的仍然遙遙無期。其中的差距已經被關閉通過使用*高分辨率顯微鏡。
一月Ellenberg和他的團隊的科學家在EMBL在海德堡獲得新的見解全國人大結構的幫助下基態損耗（GSD）顯微鏡。
什么是GSDIM方法為您的研究的優勢是什么？
在我們的研究中，我們試圖了解大型多蛋白復合物，如核孔復合體（NPC），都是建立。因為它們的尺寸和復雜性，例如分子機器是*出了單個方法的范圍和素來結構生物學的一個挑戰。原子分辨率的方法，例如X-射線晶體學或NMR需要純化樣品和不適合于非常大的程序集。雖然，電子顯微鏡允許的大復合體在其天然環境中的細胞的觀察，它往往是很困難的分配的電子密度以單個蛋白。在熒光顯微鏡中的蛋白質的身份是已知的，*分辨率（SR）現在讓我們來可視化低于衍射極限的細節。當SR被結合的顆粒平均，蛋白質的位置可以被映射到亞納米精度的規模，使得光鏡適用于大型復合物的結構研究。因此，SR顯微鏡可以連接不同類型的數據，并*終幫助生成的多蛋白裝配偽原子模型。此外，特別是GSDIM和其他本地化SR方法的一大優點是，他們是相對簡單的使用，并定期讓蛋白質在10?20 nm的間隔的分辨率。這對我們來說是重要的，因為我們可以獲取大數據集，并期待在一個相對有效的方式很多不同的標記。
什么是新的見解它給你的問候核孔復合體的結構？你去過哪些細節能夠可視化的*次？
Nucleoporins是建立核孔（見圖1）的蛋白質。*次，SR顯微鏡使人們有可能解決的幾個這些蛋白質的組織周圍的怪物。平均數千這些環允許我們測量相對于具有亞納米精度的孔的中心不同nucleoporins的位置。然后，我們可以比較系統地構成了所謂Nup107-160亞復合，這是NPC*大的建筑塊和孔結構支架的主要組成部分nucleoporins的徑向位置。
圖1 ：一個U2OS細胞標記的抗nucleoporin Nup133和綴合的Alexa Fluor 647的第二抗體抗體的核的底面。沿著傳輸軸線觀察個體的NPC如環狀結構可見。比例尺：3微米。
如何將我們的核孔復合體的認識現在要修改？
在我們*近的研究中，我們提供了Nup107-160亞復合的成員的位置約束，并根據這些數據，我們能夠解決一個長期存在的爭議中的字段：這個亞復合的取向的問題相對于所述傳輸軸。這是理解如何全國人大的結構支架的組織又邁進了一步。我們希望在未來，我們將能夠映射毛孔的所有蛋白質并提供這一重要運輸機械的綜合結構模型。
請描述你剛剛開發相結合的成千上萬的*分辨率顯微鏡圖像達到低于一納米精度的方法。
雖然SR顯微鏡使我們能夠想象周圍的人大中心nucleoporins的組織，這些圖像的原始分辨率將不足以直接看到相同的亞復合個別蛋白質之間的微小差異。因此，我們開發了一種分析方法，其染色的特異性標記個別的NPC的許多圖像在空間仔細對齊的孔的中心，或者在標記的第二信道的參考蛋白質的位置，然后被相加，以產生的平均圖像（見圖2）。由于我們使用數千結構相同的圖像，該注冊過程是非常精確的。我們然后能夠通過用適當的數學模型擬合平均信號，以確定熒光標記物的位置。重要的是，我們發現，這種平均過程的精確度取決于在一定程度上的原始數據的質量。為了使我們的測量不同的蛋白質和實驗之間*可媲美并移除劣質染色潛力的文物，我們實現了一個自動化的流水線分析控制參數，如定位精度和密度。關于生產的統計學顯著數據，我們可以在從GSDIM方法和一種有效的漂移補償（為SuMo）階段的可靠性和魯棒性另外的好處。
圖。2：例平均過程的結果。（一）一個NPC的形象標記對Nup96抗體（高斯濾波）。（二）NPC的平均圖像用針對Nup96抗體通過比對了8000圖像各個孔和求和產生。（三）圍繞人大中心對Nup96熒光標記物，從平均圖像的輪廓確定的平均位置。比例尺：0.1微米。
總而言之，我們的方法是通用的，可以測定相對于對稱結構或參考蛋白質具有亞納米精度和準確度的中心的熒光標記物的位置。應用該方法的核孔的幾個不同的蛋白質，我們可以相對于所述結構的中心分配它們的相對位置。這個信息使我們能夠確定在NPC腳手架單亞復合的方向（參見圖3）。
圖3 ：應用平均化過程在Nup107-160亞復合（由不同顏色描繪）的幾個表位，它們的相對位置可以被確定。染色是通過使用GFP融合蛋白的納米抗體的標簽來實現。位置信息被覆蓋與NPC的細胞質環的電磁結構。電子密度圖的禮貌澳Medalia教授。
什么是必須克服的制備*分辨率樣本的一般障礙？您使用了這項研究有哪些標記？
雖然工作在這個項目上，我們意識到，獲得盡可能*好的熒光標記是在一個SR實驗中*關鍵的步驟之一，*分辨率方法一般需求更高質量的樣品比傳統的顯微鏡。雖然幾個方面的樣品制備，如低背景和良好結構的保存，是很重要的，這兩個*重要的限制因素，在我們的例子中是標記試劑的大小，并且可以實現標簽的密度。*初我們用間接免疫熒光法用抗nucleoporin抗體，這使得內源性蛋白在細胞特異性標記。但是，使用的抗體的一個主要限制是它們的大小-它們可能從目標表位達15nm的偏移熒光團。此外，我們的平均方法需要高密度的標簽樣本。這是*可以實現具有非常高親和力的抗體，我們只能夠獲得這樣的試劑，我們有興趣。我們通過表達nucleoporins如GFP融合蛋白和染色樣品與小熒光解決這兩個問題的nucleoporins的一個子集標記的抗-GFP的納米抗體，這是一個常規的IgG只有十分之一的大小，從而減少潛在的*過一半的偏移。重要的是，因為這個標簽是由基因編碼它使我們能夠在一個簡單的和可比的方式標注幾個nucleoporins。為了達到*大的標記密度，我們通過RNA干擾耗盡內源性未標記的蛋白質。
你看到了使用新的GSD 3D技術在您的研究領域是什么可能性？
像所有的大蛋白復合物，人大是一個三維結構，以了解它是如何建成的*分子組裝的各個部分的高解析度3D視圖將是必要的。盡管我們近期的研究提供了新的見解NPC支架的組織，我們只能確定一個方向nucleoporins的位置 - 沿孔隙的半徑。在3D進行這種測量將更加翔實。
此外，我們相信，*高分辨率顯微鏡將成為不只是核孔，還包括其他大型集會的蛋白質結構研究的重要工具。這種簡化我們的分析 - 然而，在NPC的情況下，我們的事實，對核的底部幾百毛孔都可見相同的方向幫助。這種擇優取向未找到許多其他有趣的多蛋白裝配的，而這種復合物的*分辨率結構的研究只可能具有3D成像。