完全控制的穿透深度與徠卡顯微鏡TIRF自動對準
全內反射熒光顯微鏡（TIRF）的主要特點是激發熒光基團，而不是使用直接光漸逝波的就業問題。 倏逝波，而產生玻璃/水或玻璃/標本接口的從屬性，是其傳播z方向逐漸降低，限制了它的穿透深度大約幾百納米的樣品。 這允許位于玻璃/水或玻璃/試樣界面附近的一個小體積的細胞完全被激發的熒光基團。 研究人員普遍適用于全內反射熒光顯微鏡成像中的動態事件和關閉，如囊泡運輸，內和胞外分泌和膜販運到質膜，無可比擬的信號噪聲比和Z-分辨率。 然而，所觀察到的分子或結構，可靠控制的倏逝波的穿透深度的空間分布進行精確的陳述是強制性的。
入射角和波長的激光的穿透深度是由
倏逝波的穿透深度被定義為下降的倏逝波的界面處的初始強度的37％的范圍內，仍可獲得。 它主要取決于激光的入射角遇到玻璃/水或玻璃/標本接口。 因此，控制入射角度為必要的控制的倏逝波的穿透深度。 嚴密，精確，可靠和可重復性的激光的入射角控制也是強制性的，以確保所取得的成果的可重復性。 反過來的激光的入射角取決于在backfocal平面的目標，這是由全內反射熒光掃描儀的激光光斑的徑向距離。
圖 1：全內反射熒光顯微鏡原理
漸逝場的穿透深度的另一個決定因素是必要的用于激發的激光的波長。 這可以成為一個在TIRF實驗問題多個熒光。 在此類實驗中不同的激光線之間切換，會導致不同的漸逝波的穿透深度。 從這樣的實驗的結果的解釋，必須非常仔細地進行，作為滲透的漸逝波，因此被激發的熒光團的數目試樣的體積隨激發光波長。 為了實現可靠的，可量化的結果，它是強制性的，以保持在一恒定值的倏逝波的穿透深度。 這只能實現激光線所產生的漸逝波，如果不同的穿透深度相應地改變所選擇的激光線的入射角補償。
完全控制的穿透深度與徠卡TIRF自動對準
為了確保重復性和可靠的穿透深度，甚至當激發波長改變的倏逝波，萊卡微系統采用特殊的硬件TIRF對準一個完全自動化的過程。 的徠卡TIRF模塊的主要部分是一個全內反射熒光掃描儀，準直儀和TIRF傳感器的。 全內反射熒光掃描儀控制被放置在所述激光束的客觀backfocal平面的位置。 因此，控制在試樣的激光的入射角度。 準直的激光束進行聚焦的后部目標的平面（backfocal平面），實現了均勻的照明視場中。 的的TIRF傳感器檢測到的反射光的情況下，全內反射從玻璃/標本或玻璃/水相間。
圖 2：光通路徠卡TIRF模塊。 激光束被定位的目標，借助于一臺掃描儀。 在一個特殊的傳感器測量的總反射的返回的光束。 這種反饋可以精確，全自動，所產生的漸逝場的穿透深度和可重復的設置。 1）全內反射熒光傳感器，2）TIRF掃描儀，3）準直器，4）廣角熒光激發。 實線：耦合激光束，虛線：回來的激光束。
這使得全內反射熒光傳感器系統的一個特殊的部分，因為它允許待檢測的全內反射的發生。 因此，實驗者可以100％肯定，獲取的圖像，是真正的全內反射熒光圖像。 在完全自動化的對準過程中，全內反射熒光掃描儀的激光束移動通過backfocal平面的目標和全內反射熒光傳感器，檢測范圍的掃描儀位置處發生全內反射。 有了這個信息，然后系統計算 - 考慮到的激光束的波長 - 得到的所有可能的掃描儀位置的倏逝波的穿透深度。
后的對應是可能的激光線之間切換，同時保持一個恒定的倏逝波的穿透深度時，掃描儀將自動改變的客觀backfocal平面中的激光束的位置。 這保證了激光始終具有所要求的相對于波長的激光的入射角度，以產生所要求的漸逝場的穿透深度。 結果可自由定義，但仍然穩定，并充分的重復性滲透深度，可用于所有波長的倏逝波。
圖 3：全內反射熒光圖像的熒光標記RAB11（綠色）和GAL3（紅色）的蛋白，在MDCK細胞頂膜囊泡。 與不同穿透深度設置的圖像被收購。 左上：90納米，右上：110納米，中心左：150納米，中間偏右：200納米，左下：250納米，和底部右：EPI模式。 請注意可見小泡數量的增加和減少的信號對噪聲比。 徠卡上午TIRF MC系統獲取的圖像。 禮貌德國馬爾堡大學PHILIPPS，細胞生物學和細胞病理學研究所蘇菲博士Veitinger，。
靈活的TIRF掃描儀使河洛成像和方位選擇
雇用一個高度靈活的TIRF掃描儀具有額外的優勢。 如前所述，對系統進行精確識別，激光位置（或掃描儀的位置）內部全反射發生，反之亦然，這是不是這樣。 發生全內反射的確切位置的知識，沒有可以用來照明樣品，在一個特殊的所謂的HILO模式。如果激光遇到玻璃/水界面在低于所需的全內反射的臨界角的角度，激光束將通過試樣傾斜。 因此，只有部分的試樣所遇到的激光束，并只在本卷中被激發的熒光團。 這將導致在具有低背景和一個很好的信號 - 噪聲比傳統的落射熒光圖像的圖像。 這種方法的一個額外的好處，漂白和光毒性大大降低，延長細胞生存力，尤其是在長期的實驗。 的的HILO模式是特別適合用于定量研究的動態運動，分布或相互作用的分子和單分子跟蹤。 一個標準的應用程序是泡跟蹤。
在耦合位置可自由定義的一個全內反射熒光掃描儀的另一個優點是可以選擇的激光遇到玻璃/水界面的方向（所謂的方位）。 這意味著，可以選擇的倏逝波的波陣面的方向。 這反過來的倏逝波（水平或垂直玻璃/水界面）的傳播方向上有一定的影響。 的傳播方向反過來可以影響熒光團激發的效率，因為它們通常具有一定取向的偶極子。 徠卡TIRF系統是可能的四個方位位置之間進行選擇，以確保*佳的熒光激發。
一個聲光可調諧濾波器（AOTF）和多模激光光纖保證*快波長切換和均勻的照明系統的全內反射熒光字段
徠卡TIRF自動對準的好處是*明顯的多色全內反射熒光顯微鏡在時間推移應用。 為了這個目的，不同的激光線之間快速切換是強制的。 這是通過采用聲光可調諧濾波器，用于選擇所需的激光線，而不是一個過濾系統。 的AOTF能在幾微秒內振動的方式，基于過濾器的系統相比，減少傳輸損耗的波長之間的切換。 一個AOTF也可調諧的激光束的強度通過。 此外，百葉窗AOTF變得過時，這也加快了激光線之間的切換。
*好的可能的全內反射熒光顯微鏡的另一個因素是一個均勻的照明系統的視場。 對于激光為基礎的全內反射熒光顯微鏡，這是強烈地依賴于系統中所使用的特定的激光光纖。 通過采用多模的激光纖維，具有極高的數值孔徑，如在Leica TIRF系統的使用，可以實現*好的均勻性。
圖 圖4a：廣角乳腺癌腫瘤細胞表達的GFP標記的細胞粘附分子在細胞膜上表達的CD44的熒光圖像。
圖 4B：相同的細胞在TIRF成像。 禮貌，CNIO瑪麗亞C.蒙托亞博士，西班牙國家癌癥中心，馬德里，西班牙
