奧林巴斯顯微鏡：熒光顯微鏡的干涉激發塊

高分辨率熒光顯微成像系統及相關的定量應用中，特別是適用于在活細胞和組織的研究，需要精確的性能優化的熒光激發和檢測策略。熒光顯微鏡技術，可以沒有*的如此顯著，近年來在每一個維度的當前狀態的藝術，沒有顯著的發展，包括光學顯微鏡，熒光基團的生物學和化學，也許是*重要的，過濾技術。高度專業化，*的薄膜干涉濾光器的利用率提高了通用性和熒光技術，由以前使用明膠和玻璃過濾器依賴于嵌入式染料的吸收性能的能力遠遠*出了范圍。

目前生物研究顯微鏡技術已經越來越面向非常具體的，敏感的，多才多藝的本土化的熒光分子探針在小數字，確定它們的作用，在細胞和分子過程的*終物鏡。在目前典型的廣角落射熒光照明配置，光學過濾器組合起著至關重要的作用*大化的信號噪聲比，從而幫助平衡相互沖突的要求提高熒光激發顯微鏡，同時限制漂白和細胞光毒性。經典的落射熒光顯微鏡的特點是部分重合的激發和檢測的光學路徑，要求過濾器的補充來減少強烈的激勵光后，試樣的相互作用，為一到十之間，以允許從實際的圖像形成的一個因素經常有限數量的發射的熒光光子。高度有效的熒光過濾器組是必要的，以提供*大的激勵光的衰減的檢測途徑，在成功捕捉盡可能多的發射光子盡可能平行。非常高的探測效率的熒光發射，使整體的照度水平，*大限度地減少熒光染料的漂白和光毒性試樣相應減少。

基于光干涉現象的高性能過濾器有助于在廣角和共聚焦顯微鏡的熒光技術***的應用程序。改善特異性熒光標記的目前的進展是由于發展的技術，使抗體與各種合成的熒光探針共軛。在結合經過仔細調節的化學特性的熒光染料，更高的靈敏度，由于更好的信號 - 噪聲比所提供的光學干涉濾光器的進步，目前的熒光技術的分辨率極限延伸的可視化單分子。

干涉濾光片平面基板上沉積薄膜層特殊材料建造。它們的設計依賴于薄膜沉積和薄膜光干涉技術，這兩者都是至關重要的現代光學元件的設計，以及在半導體和光通信領域。干涉濾光器的基本結構與功能的高和低折射率材料的交替層，每一個通常的厚度的四分之一波長的整數倍的。的厚度和折射率的值的各個層，這通常是沉積在玻璃或熔融石英/石英襯底，控制在每個層的界面的光的反射波的干擾可以被用來使過濾器，以反映特定的波長，而通過仔細選擇發送等。雖然層本身是無色的，所需的作為波長的函數的結果在上面的過濾器表面的不同的干涉色，類似于一個肥皂泡的表面上所看到的色彩漩渦的外觀和相消干涉的條件的波動。

的基本過濾器的補充所需的經典的熒光顯微鏡利用寬視場落射照明，以及許多激光掃描共聚焦技術，由三個獨立的元件，通常是組合成一個光盤裝載，通常所說的作為過濾器的多維數據集或塊。該過濾器組件包括：激發過濾器，二色鏡（或分束器），和一個發射（或阻擋）的過濾器，如在圖1中示出。每一組件執行不同的特定功能，但都提高了精確利用干擾效應。在下面的章節中更詳細討論的三個濾光器元件和必要的性能規格為每特性。在一般情況下，選擇一個*佳的過濾器設置為特定的調查，需要深思熟慮的過濾器和熒光染料，在顯微鏡的照明源，以及檢測器來捕獲信號的頻譜之間的相互作用。

一個典型的現代一起的組件干涉濾光片的光譜的可見區域的熒光過濾器，提出如圖1所示。的二色性反射鏡被安裝在相對于過濾器塊的光軸成45度的角度，固定到與水泥或微型卡箍。的激發和屏障過濾器置于該塊的前面和頂面的座位上，并鎖入位置與圓形擋圈（圖1（a）條）。從顯微鏡照明器的光通過激發光濾光片進入塊，和次級熒光發射退出塊通過屏障過濾器。此過濾器設置在圖1（b）中示出的光譜輪廓。設計用于同時成像應對紫外線和綠色激發波長的熒光團，這種組合中包含的激勵濾波器，其具有兩個帶通區域（380-420和510-560納米）。需要注意的是紫外線激發的檔案傳輸值低于綠色檔案中，因為由過濾器的涂層材料在波長低于約400納米的吸收。的二色反射鏡有兩個區域的高傳輸，以適應相應的傳輸區域中的發射光濾光片。此外，類似的激發光濾光片，阻擋過濾器有兩個帶通區域，并且被設計為藍色和紅色的熒光發射的同時觀察。

如圖2中所示的是*經常采用的測量的光學過濾器的質量和性能的三個基本參數。的表面平坦性（圖2（a））是衡量從一個完全平坦的或平的表面的偏差，并計算平均波長（通常為550納米）的分數或倍數。所產生的不規則表面反射的波前畸變的表面平坦性的值的兩倍。此參數是在確定的二色性反射鏡的質量，反映激發照明在熒光顯微鏡中的前表面的關鍵。通過過濾器的平面波前 的失真被稱為傳輸失真（圖2（b）），也被測量的波長的分數或倍數。發送失真工件的外表面的平坦性，以及折射率的波動所產生的內部缺陷。外過濾器表面之間的平行度偏離角被稱為楔形（圖2（c）），這是衡量在弧秒或弧分的偏差角。圖像移位，由于光束偏差引起過多的過濾器在熒光顯微鏡的楔角是*容易出問題的神器。對于一個典型的過濾器，偏差的大小約等于二分之一的楔角。除了 圖像移位，楔形缺損能產生鬼影從離軸內部反射。

激發濾光片的主要功能是除了選定的波長帶，對應于所使用的熒光染料標記試樣的吸收特性來阻止所有來自光源的照明源。按照光源的*要求有所不同。如果使用范圍廣泛的信息源，例如汞或氙弧放電燈，其輸出，取值范圍從紫外到近紅外波長，必須排除從到達試樣。在很多情況下，合適的激發過濾器有一個有限的帶通傳輸范圍為約40納米（半*大值全寬FWHM）為中心的熒光基團的*大吸收。這種類型的干涉濾光器構成具有多個介電層沉積到浮法玻璃及密封用環氧樹脂層壓板防潮保護的吸濕性薄膜層。雖然一般被設計成垂直于光路中（零度的發病率）的位置，*近的許多過濾器的光學塊設計傾斜激發過濾器中的安裝座，以盡量減少從內部反射的干擾了幾度。采取預防措施來限制反射時尤為重要，因為潛在的高強度反射損壞激光腔采用激光照射。

由于這樣的事實，激發濾光片元件未位于熒光圖像形成的通路，光學精度的*高程度的是不需要的。激發濾光片典型地具有小于約6個弧分的楔形的設計容限，但不是必需的更精確的研磨和拋光。是必不可少的，但是，包含的異物或氣泡的缺陷，如涂層，以及施加任何環氧樹脂層壓板作為保護層，可自由。涂層的針孔也必須被消除，因為它們允許不希望的波長，通過過濾器的和減少的成像系統的信號 - 噪聲比。

二色性分束器的位置之間的激發波長和發射（勢壘）的過濾器的角度為45度的光束路徑（參見圖1）。傳統上，該光學元件被稱為作為一個二向色反射鏡，并在落射照明配置有兩個基本作用。設計作為一個專門的長通濾光片，二色光束分離器利用干涉層，以反映物鏡波長和發射他人，因此功能，以不同的波長的相對側上具有有限波長范圍內的一個窄的邊界。二色性分束器放置在一個45度角的光軸，反映較短的激發波長，在一個90度的角，并把它們傳遞沿試樣的照明軸。同時，這個關鍵元素發送較長的熒光發射波長的熒光基團，然后將其收集的物鏡和由檢測器成像。

二色性反射鏡的設計要求，必須考慮的事實，它的激發和發射光路中起到了重要作用。該涂料選擇產生*小的自體熒光，作為基片材料，通常由熔凝硅石或石英。通過利用*的干擾濾波器的設計技術，從近全反射*大傳輸過渡可以發生在很短的波長范圍，從而實現精確的歧視，激發和發射光。在除了顯示定義的光譜特性，此光學部件的物理公差是非常嚴格的。已出版的規格通常狀態的要求小于1弧分的楔形，表面平整度偏差小于每英寸10個波長（影響反射光束），發送1每英寸或更小的波長的波前畸變（影響發送的發射信號）。重要的是要注意，有限制的反射和傳輸范圍的二色性反射鏡，不能進行精確地在一個特定的波長的過渡，但發生在一個狹窄的范圍的波長。雙色分光鏡并不反映所有波長低于與100百分數效率的過渡區，并在較低的波長將開始再次發送。同樣，在傳輸特性不完全均勻的在長波長側的過渡。在許多情況下，傳輸通常是脫落在波長長于設計范圍，或在深紅光和近紅外區域具有其他的凹凸。

標準的熒光顯微鏡的過濾器設置的第三個組成部分是發射或屏障，過濾。該光學元件主要是必須阻止來自光源的激發波長，其次，僅通過所希望的光譜部分的熒光發射到檢測器。發射濾光片的光學特性，必須小心地與激發光濾光片匹配，以實現必要的，讓比較弱的熒光發射信號要被記錄的激發波長抑制的水平。常見的熒光技術可以激發光從熒光發射，甚至是一個相對較小的量能完全壓倒信號暢通激發照明亮度比*過一百萬次。通常情況下，排放過濾器的物鏡是阻止從一個特定的波長對應的激發濾光器的光密度為5.5或更大的水平。

實際上，作為第二階段的發射濾光器的功能，以除去激發光，由二色性分束器是不完全的阻止，并且也可以用來調節的噪聲電平由樣品發出的熒光二次。*準確的熒光過濾器組，發射濾波器是一個帶通風格的熒光染料的發射光譜的匹配，但在某些應用中的長通濾波器來收集較大的信號。長波發射濾波器具有這樣的缺點，通過從其他的自體熒光的熒光染料及/或更多的干擾，因此，作為結果，*高分辨率技術利用帶通濾波器。該過濾器的設計，*大限度地提高了信號 - 噪聲比的信號分量的頻譜歧視比整體強度更重要的是，在應用程序中。干擾發射過濾器必須被研磨和拋光處理，以高的精確度，二色性反射鏡的相同規格：小于1弧分的楔和每英寸的1個波長的下方與透射波前畸變。已成為通常的顯微鏡的光學軸相對于在幾度傾斜該光學元件，往往是做與激發光濾光片，以盡量減少內部反射。

在圖3顯示的是典型的長通（圖3（a））和帶通（圖3（b））過濾器的組合設計在熒光顯微鏡中的例行職責。長通濾光片組包含一個20納米帶通激發濾光片中心波長480納米，這被認為是一個狹窄的通帶范圍。二色鏡和屏障過濾器有一個截止點，分別為500和520納米波長。利用長通屏障過濾器的信號電平增加*過與帶通濾波器獲得的。30納米寬的頻帶激勵的帶通濾波器在熒光集（圖3（b））提供了更多的激發態能量比長通集中（圖3（a））對應窄。然而，阻帶通濾波器（在這種情況下，40納米）所施加的用于信號檢測的受限制的區域，降低了整體的熒光強度，到達檢測器。

干擾濾波器原理

薄膜濾光片生產技術的發展大大提高了頻譜控制的多功能性在光學顯微鏡。早期的濾波器設計包括彩色染料溶液的試管中腔，然后按順序含染料的吉利丁片，明膠玻璃組合，以及固體有色玻璃濾光片。這種過濾器，依靠吸收衰減光，堅固耐用，價格便宜，，由低峰透過率，波長歧視差，和的時候，高層次的自發熒光，但其效用是有限的。完全反射鏡和中性密度過濾器，以及用于波長選擇的的透明干擾涂層，金屬材料的薄膜涂層是現在使用*廣泛的光控制裝置。目前，干涉濾光器可以產生非常精確的式樣，使他們的光學性能，以對于大多數應用程序進行優化。利用薄膜涂層技術，可以制造各種各樣的過濾器的設計可以包括的長通或shortpass的邊緣過濾器，窄或寬的帶通濾波器，多個帶通濾波器，和二色性分束器。

干涉濾光片的多層薄膜器件。其光學特性都來源于原則支配的光的反射和透射兩種不同介質之間的接口。這些原則，可以很容易地外推到一個單一的薄膜沉積在基片上的不同組合物的光相互作用的行為，同樣變量的組成和厚度沉積在結構化的堆疊在基片上的多個薄膜層的。干涉濾光片通常通過真空沉積的金屬的鹽的光學玻璃襯底上的薄膜制造的。如果重復該過程使用幾種不同的膜材料，多層過濾器的生產，提供多個接口的光的反射或折射。

上面的空氣 - 玻璃界面的反射入射光的是一個重要的概念，調節的作用，在顯微鏡的透鏡，濾光片，反射鏡，及其他光學元件。當光線遇到一個透明的玻璃表面，約4％的總的入射輻射被反射。因此，出棧發送的8個鏡片的入射光的約50％，在16玻璃表面（前部和后部的各元素），其余的被反射。一個類似的效果是由施加在玻璃基板上的多個薄膜涂層。幸運的是，每一層的厚度和折射率可以仔細選擇，以控制特定波長的界面處的反射和透射特性。的層狀結構，因此，可以利用，無論是長或相消干涉（或中間的兩個過程的組合）之間的波陣面反射的各接口上，有選擇地產生一定的波長范圍內的優選的反射或透射。

規范建筑干涉濾光器時的臨界物理現象時所發生的光入射兩透明介質的光滑界面的反射。在這樣的界面的反射特性取決于兩種材料的入射角的入射光的偏振方向（如有的話）的折射率。當光入射界面時，光的一小部分進入所述第二介質中被折射，而另一部分被反射的界面處（參見圖4）。的入射的角度（一）和具有折射率N（1）和N（2） ，如在圖4中示出的兩種介質中的折射角（R）之間的關系，由下式給出斯涅爾定律：

與參考角的入射角和折射角（我及r），在界面上的兩個偏振成分的反射率通過下列表達式決定：

R（對）是偏振平行光入射面，簡稱為p偏振光的光的反射率，R（次）的光的偏振垂直于入射平面的，或者S -偏振的光的反射率。垂直入射時的偏振差異不發生，總反射率（R）是等效的s 和 p 分量的反射率，由下式表示：

考慮到這種關系，通過空氣（折射率為1.0），并進入具有折射率為1.5的玻璃的光學元件的光波，反射率（R）為每個空氣-玻璃表面，為0.04或0.08，在垂直入射的兩個表面。八個層疊玻璃元素在前面的例子中，通過16表面的透射率是0.96至16的功率，或約52％（相當于一個48％的反射損失）。的反射率的公式決定，玻璃在空氣中的元素（N（1）等于1.0），增加值的N（2）的反射率增加。未涂覆的玻璃的元素的反射的高損耗強調的潛在的好處，可以是來自于將光學元件的有效的防反射涂層。在光學涂層，特別是對干涉濾光器的功能是至關重要的，另外一個因素是，當光傳播通過接口，如在圖4（a）所示，如果N（2）大于N（1）時，反射波進行180度的相位變化。

兩個相鄰的介質，結合發生反射時的相位變化的折射率之間的不匹配所產生的反射率的變化，提供一種機制，通過它可被利用光的干涉，來調節所希望的波長區域的透射和反射的光學元件。通過薄層沉積在玻璃基板上的透明電介質材料，可以被控制的特定波長范圍內的反射和透射光強度沒有顯著的損失。通過選用合適的電介質的折射率，層厚度和層的數量，干擾光學系統的光譜特性，在很寬的范圍內，可定制。

是否為邊緣濾波器或帶通濾波器的作用而設計的，和相消干涉現象，通過多層薄膜設備進行波長選擇。它們是基于相同的原理，在大多數情況下，如法布里-珀羅干涉儀（圖5（a））可以被分類。這些簡單的干涉，依靠多次反射波陣面之間的相互干擾，傳輸選定的波長范圍，同時阻止其他所有波長。在這種類型的過濾器的操作機構是*好的描述首先考慮單色入射的光的簡單的例子，在一個單一的薄膜在玻璃基板上的介電涂層，該薄膜具有的折射率之間的空氣和中間玻璃上。三個介電材料，具有折射率N（1） ，N（2） ，N（3） ，圖4（b）中示出。該薄膜的厚度噸，分離的半無限厚度的材料。

由圖4所描述的配置，（b）中，會發生一些反射在各接口上，并且通常被稱為作為菲涅耳損耗（或菲涅耳反射，奧古斯丁菲涅爾命名）。反射的入射光的比例，可以由方程的總反射率（R），經分析表明，菲涅耳損耗跨越接口（N（2） - N（1） ）的增加 的折射率差變大。作為通過薄膜的光傳播到第三介質，一個邏輯的假設。將所傳輸的強度降低由發生在這兩個接口的菲涅耳損耗的總和。然而，如果膜的厚度小的（在訂單上的光的波長），反射波的兩個表面，這可以增加或減少總的結合強度之間發生干擾。干擾的性質取決于在各表面反射后的波陣面的相位關系，而這又反過來，取決于波長，材料的折射率，入射角。

如果薄膜的折射率，N（2） ，是空氣和襯底之間的中間，入射的光的反射發生在空氣薄膜界面膜-基底的界面，在圖4中所示的紅色波（二）（附注的入射角被極大地夸大了）。從界面反射的光線之間的相位關系是由膜的厚度相對于波長的光的折射率比較值。因為N（2）大于N（1） ，從*表面（薄膜的表面）反射的光波具有一個180度的相位變化。如果膜的厚度是這樣選擇的，等于四分之一的光的波長（λ/ 4）的光學厚度（厚度的商品，噸，折射率，N（2） ）時，光線通過薄膜傳播和反射膜玻璃界面的反射后，經歷了一個180度（λ/ 2）的相變。此外，第二個180度的相變發生時返回的波通過薄膜。的凈全波長相變相比，該射線的*反射射線的結果，在一個180度的相位差的兩個反射光線之間的半波長的相變，并產生相消干涉。隨著反射光線被有效地取消，四分之一波長厚度的功能的防反射光學鍍膜的薄膜。長波和shortpass的過濾器采用多個薄膜在其結構，如果設計得當，顯示防反射特性。

簡單地利用不同折射率的薄膜材料的兩個反射光之間的相位關系可以被改變。應用相同的結構如上所述，但是，而不是與薄膜的折射率大于在基板（如空氣）中，在*反射將產生相同的180度的相位變化。通過電影傳播的射線，但是并不改變相位的反射后，由于N（2）現在是大于N（3） ，只獲得正常的180度的相位滯后（λ/ 2）與雙程關聯通過厚四分之一波長（λ/ 4）膜。之間發生相長干涉的兩個反射波陣面（各具有一個180度的相位變化），從而增加的反射率的比較，從較低折射率的薄膜涂層，并作為一個部分反射鏡造成的光學元件的功能。

通過利用薄膜干涉的技術，可使用范圍廣泛的設備可以制造。是顯而易見的，從前面的討論中，薄膜涂層性能可以進行微調，利用疊加多次反射波前。波之間的干擾現象的本質是純粹的建設性的，破壞性的，或許多中間階段關系。考慮到防反射涂層結構的例子中，如果膜的光學厚度為四分之一波長的整數倍的，這兩個反射是不完全180度的相位差。因此，干擾是不完全破壞，造成的反射率*過理論*小值。其他相位關系可被用來操縱的透射和反射性質的薄膜的。分之一波長厚度的介電薄膜層產生360度的相位變化（全波），并可以作為缺席層與一個具體的設計波長的反射率或透射沒有影響。對于*的介電材料組成的結構，結合的透射和反射的射線的能量等于入射光的能量。

干擾濾波器設計

確定的透射和反射性能，使設備的一個過濾器基片上沉積薄膜層的組合物和安排。當具有相同波長的光波占據了相同的物理空間，它們互相干擾的方式由它們的相對相位和振幅。是破壞性的干擾，如果波是完全相同的淘汰（180度），并且如果它們的幅度是相等的，它們互相抵消，得到振幅為零的波。當兩個波正是他們彼此相干涉，產生一波幅度較大。由多個層組成的薄膜光學涂層的設計，以使光的層邊界之間的距離（通常是不可分割的四分之一波長的倍數）控制的多次反射和傳輸的光波的相位差。連續地施加在光學鍍膜層有效地構成的邊界的堆棧，其中每一個產生反射和傳輸組件，其后從其他界面反射和透射。通過這樣一個多層結構的色光傳播將受到破壞性的干擾和在特定波長的衰減，和建設性的干擾，增強在其他波長傳輸。

涂層的性能特性的影響由數量的界限的層狀結構，在每個邊界的折射率差，并在涂層內的邊界之間的距離。干涉濾光器制造商應用光學薄膜理論，用專門設計的軟件的幫助下，以優化針對特定應用的特點。通過不同的薄膜結構，過濾器的性能規格，可以控制具有很大的精度。其中通過薄膜的設計是被操縱的特性程度的透射和反射，透射和反射（和中間轉換）發生的光譜范圍的程度，和在非正常的入射角的偏振效應。圖6給出了關鍵的光譜特性和術語常用來描述的干涉濾光片。位置的峰值和平均透射率值，以及帶通濾波器的中心波長（CWL）和切口切斷的shortpass值（黃色曲線）和長通濾波器（藍色曲線），分別。在圖6中的帶通頻譜的配置文件（綠色曲線）的阻斷范圍也表示。

正如前面所討論的，四分之一波電介質層可以被設計為能夠在玻璃基板上，或者作為防反射涂層，建設性地執行反射。四分之一波長疊層反射器（參見圖5（b））中的兩個或更多的電介質材料的交替層組成，并且被用作用于光學薄膜裝置的基本構建塊。的每一層的光學厚度的設計滿足只在一個特定的波長值，這被稱為設備的主波長。四分之一波長疊層反射光譜的圖5（b）中所示的配置文件的方法，由23層之間交替硫化鋅（折射率為2.35）和冰晶石（折射率為1.35）的在玻璃基板上構成的裝置中，用一個主波長為550納米。可以采用甲微小的設計修改，以消除的傾角（通常被稱為“ 振鈴），優化的元素作為長通或shortpass的切口上過濾器用于在傳輸區域。該組合物的涂料表現出*高的主波長的反射，并將其發送的本金值高于和低于波長。涂層的性能是上面的主波長和傳播的波之間的破壞性干涉*小化由于整個傳輸的反射波的干涉的結果。四分之一波的棧反射是適合利用阻帶濾波器，β受體阻滯劑，切過濾。

窄帶干擾（帶通）濾波器法布里-珀羅干涉儀相同的原則下，依托多個反射光束之間的干擾。在一個典型的法布里-珀羅干涉儀（構造光譜應用，請參閱圖5（a）），入射光經過多次反射，在位于兩個反射面之間的中央透明介質（空氣）。每個被傳送的波陣面進行定義干涉儀腔表面之間的反射次數為偶數。新出現的波陣面之間的相位差確定是否發生傳輸*大，相反，大部分的光被反射回光源。盛行一個特定的條件的波長區域，對于一個給定的入射角，取決于分離的反射器，其中空氣（?等于1.0）的物理厚度等于該區域的光學厚度。

基于干涉原理的*簡單的帶通濾波器是一個的薄膜固體法布里-珀羅干涉儀，通常簡稱為腔體或單腔涂層。通常情況下，這些過濾器的分離薄膜的間隔件（圖7中所示）的兩個薄膜反射鏡構成。在全絕緣腔中，在常規的空氣間隙被替換了一層薄薄的介電材料具有相當于一個不可分割的主要設計波長（所需要的傳輸峰值）的半波長的光學厚度的。薄膜的高反射鏡是正常的四分之一波堆寬帶反射率的反射器的主要設計波長的峰值。間隔件分離的反射器，由于其半波長厚度，導致傳輸，而不是上面的主波長的反射，從而支持在空腔中的多次反射。較長或較短的波長比主波長獲取的光的相位差，*大限度地提高反射和*大限度地減少傳輸。此組合的干涉現象產生一個有效的帶通濾波器。特性的濾波器的通帶區域的寬度，電平在通帶內的傳輸，和阻擋光譜區域范圍以外的，如，層的數量和它們的排列決定。一條狹窄的通帶，這往往是一個這種類型的過濾器的設計物鏡，是通過增加的反射率的四分之一波長堆疊組成的模腔，并通過增加薄膜的間隔件的厚度。

寬光譜的變化是可能的干涉濾光器的詳細結構。雖然很多，完全采用介電材料，它是常見的寬帶干擾濾波器的設計，包括在隔板的金屬層。即使在所有的介質濾波器，金屬薄膜層通常是引入的輔助結構，作為阻擋濾光片物鏡光譜區域（圖7）。也可以采用金屬-電介質-金屬（MDM）的空腔，在應用程序中涉及的過濾紫外線，將全絕緣結構被完全吸收。在這種類型的固體法布里-珀羅干涉儀，反射金屬薄膜具有整體的半波長厚度的介電材料隔離層分隔薄膜。

典型的四分之一波長疊層反射器，如上面所討論的，從構造的高折射率和低折射率的電介質材料的交替層（參見圖7和8）。高和低折射率層構成的一對*簡單的周期，這通常是重復多次的在構造一個堆棧具有所期望的性能特性。用適當的間隔層的兩個堆棧的組合構成一個單一的腔濾波器。兩個或多個這樣的空腔可以被耦合以匹配的（缺席）層，以形成一模多腔的帶通濾波器。圖7示出一個典型的兩腔通帶的干涉濾光器的詳細結構。的商品的單個模腔的值是約相等于總的傳輸通帶，導致從多個腔結構。因此，腔體的數量增加，在通帶的截止邊緣斜坡變得陡峭，通帶外的增加（參見圖9）的反射率，生產改進的抑制相鄰的通帶區域的波長。陡峭的邊緣斜坡產生通帶峰幾乎是方形而不是高斯或洛倫茲形狀，利于某些過濾器的設計特性。

在光學薄膜技術的命名法，它是常見的象征為四分之一波長的光學厚度的高折射率材料層與字母?，并指定為L為四分之一波長光學厚度的低折射率材料層 （圖7和8）。利用各種指數和小數指定以字母組合來表示的周期數和堆棧層的光學厚度。通常，術語指定干涉濾光器的結構是特定于每個制造商。硫化鋅是一種常用的高折射率的材料，，而冰晶石，一種自然發生的氟鋁酸鈉礦物，是典型的低折射率層。隔離層是高折射率材料的半波長厚的薄膜，缺席（耦合）的層是由具有半波長厚度的低折射率材料。

正如前面所提到的，一個帶通干涉濾光器的設計中采用的空腔數量影響的能力的過濾器之間的帶內和帶外波長來區分。圖9（a）與不同數量的模腔數的理論構成的過濾器作為波長的函數的典型的傳輸的檔案。在一個相同的帶通濾波器和中心波長，模腔數增加時，通帶外的光衰減程度在更遠除去從主波長的波長更大。隨著大量的空腔，發送濾波器的通帶接近所需的方波輪廓表示之間的傳輸和衰減波長區域的急劇轉變。在實踐中，這個濾波器的特性表現出改進的波長鑒別和能量的傳遞效率更高。大幅削減，并切斷轉換帶通濾波器是有用的，他們有能力有效地分離的激發和發射波長的熒光染料，表現出的小斯托克的轉變。

的意義，提高了波長歧視雇用大量模腔的濾波器設計的結果是*佳的說明，考慮到相鄰的過濾器或腔堆棧的潛在影響滲色。在實踐中，該工件發生時，在熒光顯微鏡中，激發能的發射濾光片透過。滲色的結果是不希望的激發光的能量被檢測到的信號，作為試樣的熒光增加的背景水平，提高熒光檢測的下限。圖9（b）示出典型的干涉濾光器的傳輸特性曲線，同時使用三和五腔的設計，都集中在435和460納米的激發和發射波長分別。激發和發射波長中的小差異，所表現出的通帶剖面的陡峭的過渡五腔濾波器的設計顯著減少了潛在的滲色的發生光譜的重疊區域，在低得多的傳輸值作為結果。為了獲得可接受的水平的放氣，通過利用三腔濾波器，兩個濾波器的中心波長將必須選擇與附加的波長分離。對于熒光的小斯托克的移位，這種做法將大大降低熒光激發和檢測的效率。

除了 如上所述，干涉濾光器匹配特定的應用程序的基本設計功能，需要考慮的過濾器構造中，通過*的技術進行了優化的性能特點。取決于如何設計集成在系統中與其它組分的光學系統中的過濾器的功能水平。即使一個干擾過濾器可滿足每一個主要的性能要求，特定的光學系統標準視為一個孤立的組件時，往往需要摻入其他結構的過濾器組件。作為一個例子，利用帶光源或檢測器，工作在一個寬的光譜范圍內的過濾器需要一個機制，延伸*過一個多層鍍膜的單基片表面提供光信號的衰減范圍。此外，增加的衰減電平可能是必要的，如果采用一個非常強烈的照明源或一個高度敏感的檢測器。雖然一些光學系統提供了獨立的吸收或反射元件的摻入足夠的物理空間，這些阻擋或衰減的組件通常組合成單一組件與主干涉鍍膜。

添加專門的過濾器組件，以增加衰減總是導致在某些所需的波長的傳輸損耗，減少了總的發光系統的吞吐量。因此，阻塞的策略是設計來提供特定的應用程序發送和衰減之間的*佳平衡。例如，阻止可能被設計為提供只對符合探測器的靈敏度的波長范圍內的衰減，同時使傳輸的光能量檢測范圍之外。

在帶通干涉濾光器，例如，阻斷的通帶（長波長側）相鄰的兩腔的圖7中所示的例子中，可以通過添加多層薄膜阻擋結構。對于圖7中給出的理論的過濾器，一個金屬 - 電介質混合式阻塞的過濾器執行此功能。在典型的商業產品，具有類似的設計，多層阻塞濾波器限制或者0.01％的通帶的長波長側的透過率。通常情況下，更大的阻塞水平及隨附的整體傳輸損耗之間的妥協，必須權衡濾波器的物鏡性能的要求和更大的成本制造更復雜的組件。

延期減少或消除不需要的波長，也可以實現通過使用吸收在特定的波長區域，同時繼續傳輸所需的波長通過衰減組件的操作。吸收式的色玻璃通常用來抑制干擾濾波器的通帶的短波長側上傳輸。這樣的玻璃元件可被用作底物的干擾涂層或層壓到制造完成后的過濾器組件（參見圖7）。薄膜涂層材料，電介質和金屬，也可使用通過吸收提供衰減。除了玻璃成分吸收，染料可以添加到光學水泥在過濾器組件提供一種補充吸收值的過濾器系統的主要的帶通特性。

雖然吸收材料是理想的部分阻塞，如短波長阻塞相鄰的通帶和衰減功能，它們的規格為每一個應用程序中不一定是理想的。在許多情況下，吸收介質不提供必要程度的傳輸，吸收水平，或截止的過渡檔案中。此外，這些材料通常是容易受到由于其多余的能量吸收，這可能會導致顯著的波長偏移或物理損壞的光學系統的溫度升高。

為了提供更高水平的性能（盡管以更大的成本），介電薄膜涂層通常采用在整個設計的衰減光譜區域延伸。提供輔助過濾的主要干擾結構，這些額外的介電涂層可以施加到基材和層疊過濾器組件。的幾個阻擋元件，其可以是的長通shortpass，或者非常寬的帶通，可結合，以提供高傳輸所需的光譜區域，同時產生高反射率的區域，其中*涂層的“泄漏”不想要的波長。圖10示出了一個主要的帶通濾波器的頻譜特性與另外一些阻擋元件延伸的衰減范圍。需要注意的是通內的透光率減少一些漏光時以這種方式被淘汰是不可避免的。

許多選項可供定制干擾濾波器的性能。一種流行的替代品使用的所有介電涂層包括金屬薄膜帶通涂料。此策略是簡單的，單一涂層元素通常會延伸到遠紅外光譜區域的衰減。金屬涂層的主要缺點是，它們是吸收，并可能降低傳輸所需的通帶中的水平10％和60％之間。與此相反，一個可比較的所有介質濾波器通常允許在通帶區域中的45?85％的透射率。

單面涂布的過濾器的衰減區域的延伸的兩種常見的策略被稱為阻塞優化和阻塞的完整的。過濾器設計優化阻塞通常采用與探測器的光譜靈敏度有限，而完全阻塞過濾器具有全范圍的光譜靈敏度的探測器。阻塞特性來優化設計的過濾器相結合的電介質的通帶，通帶內的長波長側的反射器，用于短波長側的吸收玻璃的著色元素。完全堵塞的過濾器的設計采用一個金屬薄膜帶通涂層，這是常見的補充有一個彩色的玻璃成分，以提高短的波長的衰減。

大多數干擾涂料被設計成在一個正常的入射角（與光路垂直于涂層）過濾準直光。幾個方面的影響的結果，從光入射的角度以外的正常的過濾器表面的中心波長移動到一個較低的值，不同的兩個正交偏振分量，整體的透射率降低，和帶寬的增加。這些因素都必須考慮到組件的物鏡是被用于在顯著的角度，相對于正常（例如分束器），并通過過濾器時沒有擬定方向對齊，用戶通過光學設計師。的傾斜角度的影響被觀察到的兩邊緣和帶通濾波器，采用干擾涂料。對于入射角小于約25度從正常的，可以考慮透射率和帶寬的影響*小。波長偏移是顯著的，但是，有時也利用精確地調整的窄帶濾波器的中心波長。入射角偏離正常的偏振分束發生是非常重要的，雖然它可以被用來利用在某些應用中，它通常被認為是不希望的屬性的干擾涂料。角度依賴性的兩極分化，防止切割陡峭邊緣或帶通濾波器，用于在正常的發病率從45度雙色分光鏡轉換的主要限制因素。極化效應引起的干涉濾光器形式略有不同，這取決于是否在過濾器上的光入射已經是偏振的，或者被非偏振光被傳輸之前（參考圖11進一步討論）。

屬性與過濾器相對于光路的角度的變化是可以理解的，考慮了一系列具有精確控制的光學厚度的電介質層（也可能是金屬）組成的干涉濾光片。增加的入射角增加（明顯的）的層的光學厚度，并且也減少了干擾的光波之間的相位差。向較短的主波長，入射角增大，透射和反射光譜的移位發生的單層和多層介電涂層，以及干涉濾光片的更復雜的結構。一些光學過濾器（如兩色分光鏡和帶通濾波器），轉移到更短的波長在斜入射 角故意采用微調的原則波長作為一種機制。一個665LP（長通）濾波器（在665納米峰值透射率的50％）進行考慮的一個比較大的傾斜角度，例如，在以45度的入射角作為605LP濾波器。

中心波長所觀察到的減少，作為過濾器是傾斜的薄膜的折射率和入射角的函數。通過使用干擾涂層的有效折射率的一個單一的值，準直光以角度θ（適用于小于25度的角度）的主要波長偏移的入射角之間的關系簡化為下面的表達式：

其中，λ（θ）是主波長的入射角，θ，和λ（0）是在垂直入射（零度）的主波長。外部介質（N（0） ;空氣為1.0）和過濾器（n）的有效折射率的折射率的公式中的其它變量。

的干涉濾光器的有效折射率是由涂層材料和它們沉積的順序，這是在設計過程中可以控制的因素。當共同的電介質材料，如硫化鋅和冰晶石中使用建筑標準的可見光和近紅外帶通濾波器，通常的有效折射率的實驗值是1.45或2.0，根據隔離層是否是由低或高折射率材料。隔離層所選用的材料是可過濾設計師為匹配濾波器的性能，特別是應用程序的一個重要的變量。包括高折射率的間隔物（如硫化鋅）有助于*大限度地減少隨入射角的波長偏移，而低折射率隔離物的材料（通常是冰晶石）使較高的透射率和窄的通頻帶寬度。在實踐中，所觀察到的波長的變化是從計算出的值，因為實際的折射率的變化，除其他因素可能會有所差異。如果入射角是顯著的（大于約30度），透射率變得顯著依賴于偏振，通帶特性的偏離的程度，可能會觀察到一個以上的透射峰。

由于非正常的入射角的偏振變化是次要因素，在大多數光學配置，但在一些干涉濾光器的應用程序是一個重要的考慮因素。雖然這是可能的設計，以盡量減少極化效應的干擾涂料，它們不能被完全消除，如前所述，在兩個正交極化光分量之間的差可以被有利地利用在某些儀器技術。在角度大于正常，包含入射和反射光線（p偏振）比（s偏振）的入射和反射的平面垂直于振動的波，表現出不同的傳輸特性文件的平面平行于振動的光波。圖11示出的長通和帶通濾波器的光在0度的發生率，在45度的發生率，非偏振光的兩個正交偏振分量的傳輸公司，在45度的發生率。在過濾的s偏振光和p偏振光的顯著差異是顯而易見的。該曲線還表明，非偏振光表現出顯著的轉變，以更短的波長，上面的大的45度的入射角，以及一個額外的主要峰的短波長側的透射率峰。一個重要的實際考慮的是，如果以45度的二色鏡的設計，例如，以反映特定的激光的線偏振光在s平面中，它的性能會有所不同對于任何p偏振或隨機偏振的光的同的波長。

干涉現象，薄膜干涉濾光器的施工應用的性質，結果在相同的光譜性能，無論哪一方面向光源，至少在考慮到透射率和通帶附近的。但是，由于大多數的帶通干涉濾光器的構造與吸收輔助阻擋元件，該過濾器的每一側一般有一個明顯不同的外觀。一側通常會出現鏡像或高反射率的，幾乎無色的，而另一邊則可能會出現深色或不透明。在大多數應用中，過濾器應是具有高反射率的金屬狀的表面面對輻射源取向。在此配置中，大部分被反射的輻射過濾器所拒絕相差的過濾器組件的內部部件，*大限度地減少加熱的吸收玻璃元素，減少在組件上的熱應力。制造商通常放置箭頭或類似的標記，以指示正確的方向在光路中的過濾器邊緣。

干涉鍍膜生產方法

干擾濾波器的建設依賴于精確的沉積非常薄的材料支撐基質層上具有合適的光學特性。薄膜的生產技術是一個復雜而廣泛的領域，這是電子和光學工業的一個重要組成部分。這里介紹的方法產生干擾濾波器，只有一般的總結。利用薄膜干涉涂層的材料選自一組有限，具有適當的光學性能為物鏡應用。的透射，折射，在感興趣的波長的吸收特性必須是適當的。另外，在蒸發和冷凝性能是在涂覆過程中被認為重要的變量。

薄膜光學涂層通常是通過真空蒸鍍工藝制造的，如真空蒸發或濺射。物理氣相沉積（PVD）工藝非常適合于精密過濾涂料的生產，因為這種類型的過程中的幾何形狀的厚度監控和自動化控制技術是兼容的。物理氣相沉積是一種原子化的過程，在這過程中揮發的材料從固體源在氣相中被輸送通過真空或低壓氣態或等離子環境到襯底上，并隨后冷凝。熱電阻或電弧蒸發法，濺射法，離子鍍技術，通過真空蒸鍍PVD工藝。

無論的蒸氣沉積薄膜涂層的制造方法，制造過程的某些方面是相似的。一些未涂覆的襯底被放置在一個大的腔室，是能夠實現高真空（如在圖12中示出）。對每種材料被蒸發并沉積在一個單一的生產運行的源頭被放置在室中之前，它的疏散。多層涂層被沉積在一個連續的運行，而無需打開真空室。在大多數情況下，基片被安裝在設備上，使他們能夠在做行星運動的旋轉，每個基片的蒸汽產生*均勻的曝光。小心控制的源材料蒸發率和沉積條件，如溫度，壓力，和源襯底的幾何形狀，結果在到旋轉的基片的均勻凝結的蒸氣云，以形成連續的薄膜涂層。

隨著沉積的進行，監測的光學膜厚度的增加，基片被屏蔽，實現所需的精確的光學厚度時，停止或汽化。多層涂層通常由多達百層，所生產的重復周期與兩種或多種材料，按照要求的順序沉積的涂層。的光的監視過程中用于控制膜沉積利用過濾器正在生產的涂料相同的干擾特性。在涂覆周期，監視器的特定波長的光束穿過真空腔室，入射參考基板上的空白。從基片上反射的光被檢測到與光電倍增管的移動設備是相敏的。沉積層的厚度上的空白基板的增加，反射光強度的變化，根據其中的反射光束發生干涉的性質。在一個近似正弦波圖案的反射強度的振蕩交替地達到和相消干涉的條件。交替強度曲線的轉折點代表四分之一波和半波光學厚度在顯示器的波長，與分離的中間厚度值的那些點。每一層的沉積終止的監視電路，在適當的反射率值。

雖然眾多的技術已被開發用于汽化涂層材料在真空蒸鍍法中的應用，其中只有兩個是通常采用的薄膜干涉濾光器的制造。原來的方法，可以追溯到初始真空鍍膜技術的發展，仍然被廣泛使用，依賴于小折疊帶（或船），鎢，鉬，鉭涂層材料直接加熱電阻熱蒸發。通過傳遞一個高電流通過船，涂層材料被加熱汽化，并通過在真空室遷移，必須重新凝結成在基片上的薄膜。熱蒸發遭受了一些問題。的主要困難是要求的高溫熔融有用的涂層材料，它產生的副反應造成的污染的淀積薄膜。此外，許多材料具有所需的光學性能，再加上高的耐用性和透明度是，歷史上已被被玻璃和陶瓷材料的制造中采用的相同的難熔氧化物。這些耐火材料，尤其是金屬氧化物的熔點高，防止他們被蒸發金屬小船，自己在較低的溫度下融化。如果限于此蒸發技術，只能生產薄膜涂層材料具有相對較高的波動（中度熔化點），不幸的是表現出相當差的耐久性和耐環境性。也使得這些電影的低彈性產生復雜的過濾器，需要許多涂料層是不現實的。

電子束***的熔點或升華的源材料的發展已減輕許多電阻加熱技術所固有的問題。 電子轟擊已成為光學薄膜生產的優選方法，使之有可能難熔金屬的揮發氧化物，如二氧化硅，鋁和鎂的氧化物，以及過渡金屬氧化物，包括二氧化鈦和氧化鋯。該方法涉及到涂層材料中包含的大型冷卻坩堝聚焦高通量的電子束（約1安培在10千伏的潛力）。強烈的局部加熱和汽化的源材料，避免任何反應相對涼爽的坩堝。此外，電子***可以集中需要產生足夠的強度甚至具有極低的揮發性物質汽化。進一步的創新，往往是與電子束熔融結合采用的是引進的低氧氣分壓力的腔室，在蒸發過程中的氧化物材料（稱為反應蒸發），以提高工藝產量。

近年來，一些新的制造技術已被開發，使通過物理氣相沉積方法生產的薄膜涂層的性能的顯著改善。簡稱為精力充沛的PVD制程中，*常見的例子是離子輔助蒸鍍，離子束濺射，磁控濺射。含能PVD法，在許多情況下，制造具有改進性能的薄膜，包括更高的密度，折射率越高，結果減少光譜性能的靈敏度溫度和水分，和優異的機械特性（如耐久性）。

無論是直熱式或電子束蒸發源材料蒸發的方法，利用離子輔助沉積的修改。在涂覆過程中，用離子轟擊基片的高能離子源的添加導致的薄膜層中的填充密度增加，和一個相應的增加，折射率和改進的機械特性的涂覆的基材。較稠密的包裝薄膜中的空隙減少，減少水的吸收，這是一個常見的原因是機械故障和光學特性的變化的潛力。根據被沉積在薄膜上，可以采用各種的離子種，包括氧氣或惰性氣體如氬氣。

高能離子源的離子束濺射技術，使用具有高流速的離子轟擊的金屬或介電氧化物靶。靶材料的原子數的物理位移，或濺射時，從靶表面的一部分，這些凝結成薄膜的涂布基板上。的一個變化的過程中，有時也稱為“ 雙離子束濺射，以及第二離子束轟擊薄膜的生長過程中與氧氣，氬氣或其他氣體的離子輔助轟擊有時利用蒸發技術相似的方式在。

的第三能量PVD工藝，反應磁控濺射法，已被應用在生產干擾涂料。此技術的優點是創建相當于離子束濺射薄膜具有理想的性能的薄膜，但在更高的沉積速率。反應磁控濺射法采用直流磁控濺射的金屬或者半導體靶產生反應形成所需的氧化物層與基板的薄膜。已發現，以提高該過程的變化，在薄膜生長過程中的襯底，包括氧離子轟擊。

可以使用各種各樣的襯底材料的薄膜干涉濾光器的制造，并且被選擇，以滿足其預定的應用程序的光學和機械要求，以及它們的物理性質與所需涂層材料的相容性。其中光學基片材料，在各種應用中是顯著的屬性是感興趣的，熱膨脹系數，密度，和耐激光損傷的波長范圍內的透射率。的材料也應是耐化學腐蝕，機械和熱沖擊。比較常見的光學基材材料是氟化鎂，氟化鈣，1 SUPRASIL多種熔融石英（商品名），紫外級熔融石英，Infrasil 301（稠合的天然石英具有低羥基含量的產品的商品名），水晶石英，BK7（一種硼硅酸鹽冠光學玻璃），和藍寶石。

其他注意事項激光掃描共聚焦系統

掃描共聚焦技術的實施，創造了一些額外的要求，利用熒光成像的光學元件，包括干涉濾光片的熒光集的一部分。采用激光照射時，一個常見的誤解是一個特定的激光產生的光只有一個波長。事實上，幾乎每一個激光產生額外的諧波和在多個波長的散射光。雖然這些輔助線的強度通常是低相對的主要光譜線（或線），它們可以，然而，嚴重影響系統的信號 - 噪聲特性。往往微弱的熒光信號，可以完全掩蓋了所需的發射線下降的諧波或散射光，如果在相同的波長區域的噪聲。為了緩解這一潛在的問題，作為*光學元件的照明路徑中的激光清理過濾器結合。此過濾器，在效果，激發濾光器的變形的變化，和激光照明，必須以研磨和拋光到高的光學質量。雖然懷德菲爾德技術不需要照明路徑中相同的精度，拋光清理過濾器應表現出透射波前畸變小于一個波長的每英寸的共聚焦應用。

同樣，楔形規范清理過濾器應被*小化（小于1弧分），以允許不同的過濾器中使用的相同的光束路徑（對于一些激光線）未經調整的光學。這種類型的過濾器通常是制造層結構，*大限度地提高反射性能，以避免熱損傷的過濾器，從強激光輻射。然后，清理過濾器安裝在幾個度的角度從垂直于（相對于光軸），以防止過度的反射光重新進入激光腔，并產生損壞，這將減少激光壽命。一個典型的激光清理過濾器的物鏡是阻止所有光線從激光源，除了約10納米的通帶。

在共聚焦熒光應用，二色鏡或分光器還必須滿足更嚴格的規范，比那些需要廣角鏡。無論是透射波前畸變和楔規格應不*過每英寸的一個波長。任何以某一角度放置在光路的光學元件，因為可以引入偏振變化，還必須考慮這個因素的二色鏡，特別是因為大多數的激光光源的偏振。的兩個正交極化光束分量的不同分束器的透射或反射的檔案可能會導致在一個極端的情況，即在一個方向偏振的光被反射，而相同的波長，但在垂直方向上偏振的光，被發送。

共聚焦熒光系統中的發射濾光片的功能是等同于在傳統的寬視場顯微鏡，雖然必須封鎖激發輻射發生在一個窄的光譜區。較寬帶的照明光源（如水銀弧光放電燈）的激光激發線功率的增加，可能需要更嚴格的阻塞規格的主要的激發波長的激光源的過濾器被設計。發射濾光器通常是研磨和拋光，精密的光學規格為寬視場顯微鏡，而這通常被認為是適合于共焦成像。共焦掃描系統中，形成圖像的像素由像素的光電倍增管檢測器的信號以串行的方式從發射濾光片的嚴格要求的重要性，也有一些分歧。由于需要保持共焦和排除平面信號精度高，額外的精度可能是有益的程度，它限制了信號失真。

結論

許多專門的顯微鏡技術受益顯著從干涉濾光器的操作的基本原則的事實，啟用了一個大實用的范圍內的過濾器的光學性能的相對簡單和精確的操作。的干涉濾光器技術的成功的關鍵之一是制造方法的通用性，這使生產的一個巨大的各種過濾器的許多應用中。一旦建立的設計細節，通過計算機建模和仿真測試，完全不同的過濾器可以，在某些情況下，由制造簡單，加載不同的源材料的真空鍍膜系統和重新編程的涂層參數的變化。沉積折射氧化物的材料使用充滿活力的物理氣相沉積技術的能力，極大地推進了生產高性能的實用干擾過濾器廣泛的應用，包括高分辨率，高靈敏度熒光顯微鏡。