奧林巴斯顯微鏡：什么是共聚焦顯微鏡？

共聚焦顯微鏡提供了比傳統的寬視場光學顯微鏡的幾大優勢，包括深入現場，消除或減少的背景信息的焦平面（即導致圖像退化）的控制能力，并有能力從厚標本收集串行光學部分。基本鍵的共焦方法是利用空間濾波技術，以消除在標本的厚度*過了立即的焦點平面的聚焦光或眩光。已經有一個巨大的爆炸在激光共聚焦顯微鏡的普及，近年來，部分原因是由于相對容易地獲得極高質量的圖像可以從常規熒光顯微鏡標本準備，以及越來越多的應用在細胞生物學依靠固定和活細胞和組織成像。實際上，激光共聚焦技術被證明是以往任何時候都實現在光學顯微鏡中*重要的進步之一。

在傳統的廣角光學落射熒光顯微鏡，常發生繼發標本發出的熒光通過興奮體積和客觀焦平面功能在于掩蓋分辨率。由較厚的標本（大于2微米），通常表現出熒光發射高度的*精細的細節丟失的問題是復雜的。共聚焦顯微鏡提供只有很小的改進在兩個軸向（Z ;沿著光軸）和橫向（X 和Y在試樣平面）的光學分辨率，但是能夠排除繼發的焦平面中刪除的區域，從得到的圖像的熒光。雖然分辨率有所提高，比傳統的寬視場技術的共聚焦顯微鏡，它仍然是相當少的比透射型電子顯微鏡。在這方面，激光共聚焦顯微鏡，可以考慮這兩個經典的方法之間的橋梁。

圖1給出的是一系列的圖像比較選擇viewfields，在傳統的廣角和激光掃描共聚焦熒光顯微鏡。人類髓質廣角熒光熒光染色厚的部分展品大量眩光焦平面上方和下方的熒光結構（圖1（a））。當成像激光掃描共聚焦顯微鏡（圖1（D）），髓質厚部分揭示了一個顯著的結構細節程度。同樣地，整個兔肌肉纖維的寬視場熒光成像用熒光素染色，產生模糊的圖像（圖1（b）），缺少細節，而同一標本字段（圖第1（e））揭示了在共聚焦顯微鏡的紋狀地形。向日葵花粉顆粒的自體熒光產生一個模糊的輪廓基本的外部形態（圖1（C）），但產生的內部結構沒有跡象。與此相反，一個薄的光學部分相同的晶粒（圖1（g）），用共焦技術獲得顯示的粒子芯部和周邊包絡之間發生顯著變化。

歷史視角

共聚焦顯微鏡的基本概念*初是由馬文·明斯基在20世紀50年代中期（于1957年獲得**），當他是哈佛大學的博士后學生。明斯基在未染色的腦組織準備，并希望圖像的神經網絡，圖像生物事件發生在他們生活系統的愿望驅使下。明斯基的發明仍然在很大程度上被忽視，因為*有可能缺乏強光源必要的成像和計算機需要處理大量數據的馬力。明斯基的同事，M. David Egger和Mojmir Petran fabricated上一個20世紀60年代中后期，多光束激光共聚焦顯微鏡利用一個旋轉（尼普科夫）磁盤檢查未染色的腦切片和神經節細胞。艾格繼續在這個舞臺上，繼續開發的*個機械掃描的激光共聚焦顯微鏡，并于1973年出版了*個可識別的細胞圖像。在20世紀70年代末和20世紀80年代，在計算機和激光技術的進步，加上新算法的圖像數字操縱，導致越來越大的興趣在激光共聚焦顯微鏡。

碰巧的是，明斯基的**過期后不久，實用激光掃描共聚焦顯微鏡設計工作手段翻譯成一些研究者。荷蘭物理學家G. Fred Brakenhoff開發掃描共焦顯微鏡在1979年，而幾乎同時，科林·謝潑德的理論形成圖像的技術貢獻。布拉德·阿莫斯，托尼·威爾遜，約翰·懷特培育的概念及更高版本（在80年代末），在考試中的熒光生物標本展示聚焦成像的效用。出現在1987年*個商業工具。在20世紀90年代，光學和電子學的進步，得到了更加穩定和**的激光器，高效率的掃描鏡單元，高通量的光纖，更好的薄膜介質涂料，和探測器具有降低噪音特性。此外，熒光染料激光激發線更仔細匹配開始合成。加上迅速發展的計算機處理速度，增強了顯示器，大容量存儲技術，20世紀90年代中后期出現，舞臺已經搭好了一個虛擬的爆炸激光掃描共聚焦顯微鏡的應用程序，可以有針對性的數量。

完全集成的電子系統中，在光學顯微鏡的結構，它由一個或多個電子檢測器，一臺計算機（圖像顯示，處理，輸出，和存儲），和一些激光系統中起著核心的作用可以被認為是現代共聚焦顯微鏡波長選擇裝置和光束掃描組件結合。在大多數情況下，在各個組件之間的集成是如此的徹底，整個共聚焦顯微鏡，通常統稱為數字或視頻成像系統能夠生產電子影像。現在被雇用這些顯微鏡進行例行調查，在分子，細胞和活組織，僅僅在幾年前是不可能的。

共聚焦顯微鏡的原理

落射熒光激光掃描顯微鏡共聚焦原理圖如圖2所示。發出的相干光的激光系統（激勵源）通過一個針孔孔徑，位于在一個共軛面（共焦），在試樣上的掃描點定位在前面的檢測器（光電倍增管）和第二針孔孔徑。由于激光二色性反射鏡被反射，并掃描整個試樣，在一個確定的焦平面，二次發射的熒光點在試樣上（在相同的焦平面）傳回通過二色鏡，上面的共聚焦點集中探測器針孔光圈。

顯著量的熒光發射發生在點的上方和下方的物鏡焦平面不是共焦針孔（稱為對焦的光線在圖2中），在孔徑平面形式延伸艾里磁盤。因為只有一小部分的滿分聚焦熒光發射是通過針孔孔徑，大部分外來光的未檢測到的光電倍增管和不向所產生的影像。二色鏡，屏障過濾器，激發濾光器執行類似的功能相同的部件，在寬視場落射熒光顯微鏡。再聚焦共焦顯微鏡中的目標轉移到新的共焦針孔的光的光源和檢測器的孔的平面，成為在試樣的激發和發射點。

在傳統的寬視場落射熒光顯微鏡，整個標本進行強光照射，從一個不連貫的汞或氙弧放電燈，二次熒光發射所產生的影像可直接在目鏡觀察或投影到的表面的電子陣列檢測器或傳統膠片平面。在這個簡單的概念相反，在共聚焦顯微鏡的圖像形成的機理是根本不同的。正如上面所討論的共聚焦熒光顯微鏡包括多個激光激勵源，一個掃描頭，帶有光學和電子元件，電子檢測器（通常是光電倍增管），以及計算機采集，處理，分析，和顯示的圖像。

掃描頭是在共聚焦系統的心臟，并負責光柵化的激發掃描，以及從檢體收集的光子信號所需要的組裝的*終圖像。一種典型的掃描頭包含從外部激光光源，熒光過濾器設置和調整為不同熒光波長的色鏡，光柵掃描振鏡反射鏡系統，可變針孔孔徑產生的共聚焦圖像，光電倍增管檢測器的輸入。掃描頭組件的總布置圖3為一個典型的商業單元。

在落射照明掃描共聚焦顯微鏡，激光光源和光電倍增管檢測器都從試樣分離的目的，它的功能作為校正的冷凝器和客觀組合。內部熒光過濾器組件（例如作為激發和屏障過濾器，二色性反射鏡），中性密度濾光片都包含在掃描單元（參見圖3）。干擾和中性密度過濾器被安置在旋轉炮塔或滑塊，可以被插入到光路中，由操作員。激發激光束掃描單元被連接到一個光纖耦合器，然后由光束擴展器，使薄膜的激光束的手腕，以完全填充的目標后部孔（在共聚焦顯微鏡中的一項關鍵要求）。擴展的激光通過顯微鏡的物鏡的光由耦合在整個試樣平面柵格圖案的檢流計鏡（點掃描）掃描形成一個強烈的衍射光斑。

掃描單元的*重要的組件之一是針孔的孔徑，作為上面直接放置在光電倍增管前的共軛像平面的空間濾波器。通常包含幾種不同直徑的孔的旋轉轉塔上，使操作員調整針孔尺寸（和光學部分的厚度）。二次熒光由物鏡收集退掃描相同的檢流計反射鏡形成的柵格圖案，然后通過屏障過濾器才達到針孔孔徑。光圈用于排除從聚焦位置的上方和下方的焦平面上，而是投射到艾里磁盤具有的直徑要大得多，比形成圖像的光圈值的功能的熒光信號。這些過大的磁盤，分布在一個比較大的區域中，使只有一小部分的光通過小孔原產于平面相差的焦點。針孔的孔徑也可以消除通過光學系統的雜散光。耦合的孔徑限定點的掃描針孔空間濾波器，可在共軛像平面是共焦顯微鏡的一個基本特征。

對比廣角和共聚焦顯微鏡的相似性和差異時，往往是有用的，比較字符和幾何技術用于照明的標本。傳統的寬視場落射熒光顯微鏡的物鏡聚焦在寬的光錐在一個大的試樣的體積，這是均勻地，同時點亮（圖4（a）中示出）。大部分的熒光發射定向背對著顯微鏡物鏡（根據數值孔徑）收集并投射到目鏡或探測器。其結果是一個顯著的量的信號，由于背景光發射的和自體熒光源自區域的上方和下方的焦平面上，從而嚴重降低的分辨率和圖像的對比度。

的激光共聚焦顯微鏡的照明源是*物鏡后孔徑擴大到充滿，然后聚焦透鏡系統的一個非常小的點的焦平面上（圖4（b）條）。照明點的大小范圍從約0.25到0.8微米的直徑（取決于物鏡的數值孔徑）為0.5?1.5微米，深亮強度。共聚焦光斑大小是由顯微鏡設計，波長入射激光的，客觀的特點，掃描單元設置，試樣。圖4展示的是典型的照明錐體的寬視場（圖圖4（a））和點掃描共聚焦顯微鏡（圖4（b））在同一數值孔徑之間的比較。的寬視場顯微鏡試樣的整個深度在很寬的區域被照亮，而樣品被掃描以精確聚焦在焦平面的共聚焦顯微鏡中的點為中心的照明。

在激光共聚焦顯微鏡，延長標本的形象產生聚焦光束掃描整個定義的區域在光柵圖案由兩個高速振蕩鏡振鏡電機驅動控制。的一個反射鏡的移動，由左到右的光束沿x橫軸，而其他轉換的y方向的光束。沿著x軸的每一個掃描后，該光束被迅速運回的開始點，并沿y軸的上移，以開始一個新的掃描中的處理被稱為反激式。在回掃期間的操作中，圖像信息被未收集。以這種方式，在一個單一的焦平面在試樣上的區域感興趣的激發的激光照射來自掃描單元。

由于每個掃描線通過沿試樣的橫向的焦平面，熒光發射由物鏡收集，并通過共聚焦光學系統傳遞回。掃描反射鏡的速度相對于光的速度是很慢的，所以如下的二次發射的光路是相同的原來的激發光束沿著光軸。返回的熒光發射通過檢流計式反射鏡系統被稱為為descanning。在離開掃描鏡，熒光發射通過直接通過二色鏡，聚焦在探測器針孔孔徑。在試樣激發光通過光柵掃描模式不同，熒光發射針孔孔徑保持在一個穩定的位置，但強度隨時間波動的照明點橫越激發試樣產生變化。

通過針孔孔徑的熒光發射，被轉換成模擬電信號，由光電倍增管具有連續變化的電壓（對應于強度）。的模擬信號是周期性采樣，并轉換成像素由模擬到數字（A / D）轉換器安置在掃描單元或隨附的電子柜。的圖象信息被暫時存儲在計算機的圖像幀緩沖區卡，并在監視器上顯示。重要的是要注意，一個試樣的共聚焦圖像重建，逐點，從由光電倍增管和相應的電子發射光子信號，但從來沒有作為一個真正的圖像，可以觀察到通過顯微鏡目鏡存在。

激光掃描共聚焦顯微鏡配置

基本顯微鏡的光學系統的特點，從根本上保持不變，幾十年來，由于工程目標設計，大多數樣品的靜態屬性，而事實上，該決議是由光的波長的限制。然而，熒光探針，添加生物標本，并與光學顯微技術和其它技術的對比，有顯著改善。共焦方法的爆炸性增長和發展的直接結果是光學顯微鏡的復興已經在很大程度上得益于現代光學和電子技術的進步。其中有穩定的多波長激光系統，提供更好的覆蓋范圍的紫外線，可見光和近紅外光譜區的，改進的干涉濾光器（包括二色性反射鏡，障礙物，和激發濾光片），敏感的低噪聲寬頻帶探測器，并更**的計算機。后者是成本相對較低的存儲器陣列，圖像分析軟件包，高分辨率的視頻顯示，和高品質的數字圖像打印機。的信息流通過一個現代的共聚焦顯微鏡的示意于圖5。

雖然許多這些技術已經獨立開發為各種專門針對性的應用程序，他們已經逐漸被納入主流的商用激光共聚焦顯微鏡系統。在當前的顯微鏡系統，設計的分類的基礎上利用該技術來掃描試樣。都可以完成翻譯階段中的X，Y，Z方向的掃描，而激光照射點的被保持在一個固定的位置，或者本身可以被光柵掃描整個試樣的光束。由于三維翻譯的階段是既麻煩又容易振動，*現代化的儀器采用某種類型的光束掃描機制。

在現代的共聚焦顯微鏡，兩種根本不同的光束掃描技術已被開發。 單束掃描，在大多數的商業激光掃描顯微鏡比較流行的方法之一，使用計算機控制的一對檢流計鏡掃描試樣在大約每秒一幀的速率的柵格圖案。使用聲光器件或擺動鏡，可以實現更快的掃描速率（視頻速度附近）。與此相反，多光束掃描共聚焦顯微鏡配有一個旋轉的尼普科夫盤含有的針孔陣列和微透鏡。這些工具通常使用電弧放電照明燈，而不是，激光器減少試件破壞和實時圖像采集過程中，提高了檢測的熒光水平低。的多束顯微鏡的另一個重要特性是它們能夠容易地捕捉圖像，用陣列檢測器，如電荷耦合器件（CCD）攝像系統。

所有激光掃描共聚焦顯微鏡的設計是圍繞著傳統的直立或倒置研究級光學顯微鏡。然而，而不是標準的鹵鎢燈或汞弧放電燈，作為光源，以激發熒光團在試樣中使用的一個或多個激光系統。圖像信息的收集逐點與一個專門的檢測器，例如一個光電倍增管或雪崩光電二極管，然后由主計算機，也控制掃描反射鏡和/或其他裝置，以便收集和顯示圖像的數字化處理。經過一系列的圖像（通常是串行光學部分）已經采集并存儲在數字媒體上，分析可以利用許多圖像處理軟件的主機或輔助計算機上可用的軟件包。

共聚焦顯微鏡的優點和缺點

激光掃描共聚焦顯微鏡的主要優點是能夠通過熒光樣品的厚度范圍為50微米或以上的連續生產薄的（0.5?1.5微米）的光學部分。收集圖像系列協調顯微鏡微調對焦機制（使用步進電機）的增量變化與連續圖像采集的每一步。圖象信息被限制為一個明確定義的平面上，而不是從遠程位置在試樣所產生的信號被復雜。以上的寬視場的技術，由于背景熒光的和改進的信號與噪聲的減少，顯著提高對比度和清晰度。此外，光學切片消除了物理切片和傳統形式的顯微組織標本的熒光染色過程中發生的文物。非侵入性的共聚焦光學切片技術使具有增強清晰度的條件下的各種活的和固定的標本的檢查。

奧林巴斯顯微鏡

共聚焦顯微鏡的軟件產品的，光學部分是沒有限制的垂直橫向平面（x- y），但也可以在橫向平面收集和顯示。x - z和y - z平面的垂直部分（顯微鏡光軸平行）可以很容易地產生的大多數共聚焦軟件程序。因此，試樣出現，就好像它一直切片在一個平面上的垂直于橫軸。在實踐中，垂直部分相結合，沿z 軸方向與該軟件采取了一系列的xy掃描，然后突出的熒光強度，因為它會出現顯微鏡硬件應該能夠實際執行的垂直剖面圖。

在圖6示出一個典型的堆棧通過向日葵花粉粒露出內部的自發熒光發射波長中的變化的光學部分（通常稱為z軸系列）。垂直于z軸（顯微鏡光軸）使用雙氬離子（488納米;綠色熒光）和綠色的氦/氖（543納米的紅色熒光）激光系統的光學部分都集中在0.5微米的步驟。花粉粒從這個物種范圍20至40微米，直徑廣角熒光顯微鏡（參見圖1（c））產生的圖像模糊，缺乏對內部結構的細節信息。雖然只有12通過這一系列的*過48采集圖像的列中所示，它們代表個別相隔的距離為大約3微米的焦平面的內部晶粒結構，并提供一個很好的指示。

在標本比花粉粒更復雜的，復雜的相互連接的結構元件可以是難以辨別，從順次獲取通過用激光掃描共聚焦顯微鏡的試樣的體積大型系列光學部分。然而，一旦已經收集到足夠一系列的光學部分，它可以被進一步加工成的試樣，使用體繪制計算技術的三維表示。這種方法是在共同使用，以有助于闡明許多生物調查中的細胞和組織的結構和功能之間的相互關系。光學部分，以確保有足夠的數據被收集，以產生一個有代表性的卷映像，應記錄在適當的軸向（z步驟）間隔，以便反映在圖像中的試樣的實際深度。

伴隨商業聚焦工具的軟件包能夠產生復合和多維視圖的光學部分采集的數據從Z系列形象棧。可以采用三維軟件包，創建一個三維代表性的標本（圖7）或視頻（動畫）序列編制的標本量的不同意見。這些序列經常模仿旋轉或類似的空間變換，增強了試樣的立體字升值的效果。此外，許多軟件包使調查進行測量的長度，體積和深度，特定的參數的圖像，如不透明度，可以交互的改變，還以顯示內部結構，在不同層面內的試樣。

通過串行光學切片標本典型的三維表示的是圖7中給出。花粉粒在圖1和圖6中所示的光學部分，合并產生的真實視圖的外表面（圖7（a）條），因為它可能會出現，如果通過掃描型電子顯微鏡檢查。利用構造的三維模型的算法，使用戶能夠檢查通過360度旋轉花粉。的組織培養細胞中，在圖7（b）中是來自于轉染的中國倉鼠卵巢（CHO）線，并與嵌合質粒載體含有綠色熒光蛋白和人類免疫缺陷病毒（HIV）在細胞核中表達的蛋白質，是（因此，貼標核區）。厚的組織切片也很容易被以三維光學部分構造。幾種熒光團標記的小鼠小腸部分，圖7（c）中示出，在從一摞45的光學部分。

在許多情況下，產生一系列的光學部分的復合材料或投影視圖提供了一個三維的試樣比一個多維視圖有關的重要信息。例如，熒光標記的神經元具有在組織切片中的許多薄的，擴展的過程是困難的（如果不是不可能的話）使用寬視場中的技術，由于聚焦模糊的圖像。共聚焦*薄切片，每個相同的神經元揭示了幾個擴展部分，但這些通常出現零散的條紋和圓點和缺乏連續性。創建壓扁了一系列的光學部分神經元的綜合意見，就會發現所有的擴展過程中大家關注的焦點，具有明確的連續性。結構和功能的分析的其他細胞和組織切片也有利于從復合材料的觀點，而不是，或再加上，三維體繪制技術。

在共聚焦顯微鏡中的進展成為可能的活細胞和組織，包括圖象信息作為時間的函數的多種顏色（使用兩個或更多個熒光團）中的x，y，z尺寸的多維視圖。個人形象棧批量加工后，得出的數據可以顯示實時三維彩色視頻序列。需要注意的是，不同于傳統的廣角鏡，利用共聚焦顯微鏡，熒光染料在乘法標記的標本出現在寄存器。無論是從時間推移進行的實驗在較長期間內，或通過在短的時間內更小的幀的實時圖像采集時態數據可以被收集。使用多維共聚焦顯微鏡在細胞生物學中的一個**的工具的潛力繼續成長為新的激光系統的開發，以限制細胞損傷和計算機處理速度和存儲容量的提高。

掃描共聚焦顯微鏡的其他優點包括：能夠調整倍率的電子通過改變由激光掃描的區域，而無需改變目標。此功能被稱為縮放因子，通常是通過改變激光掃描采樣周期來調整圖像的空間分辨率。增加的變焦倍率降低試樣的掃描區域，同時降低掃描速率。其結果是可比的長度，從而增加圖像的空間分辨率和主機上的電腦顯示器顯示倍率沿增加的樣本數。共焦變焦顯微鏡的光學分辨率低數值孔徑和放大倍率目標時，被用來收集數據，通常采用數字圖像分辨率相匹配。

所收集的共聚焦顯微鏡的光電倍增管（或類似的檢測器）的模擬圖像數據的順序數字化有利于計算機圖象處理算法的轉化成離散的數字增量，對應于光強變化的連續電壓流。另外的好處和處理數字數據產生的速度，圖像可以很容易地準備打印輸出或出版的。在精心控制的實驗中，也可以通過以下方式獲得的定量測量空間的熒光強度（靜態或作為時間的函數的）的數字數據。

共聚焦顯微鏡的缺點主要是有限的可與普通激光器（以下簡稱為激光線），這發生在很窄的頻帶，并且是昂貴的生產，在紫外區域的激發波長的數量有限。與此相反，傳統的寬視場顯微鏡使用基于汞或氙弧放電燈提供全范圍的激發波長在紫外，可見和近紅外光譜區的。另一個缺點是有害的高強度激光照射到活細胞和組織（*近已經解決一個問題，通過多盤共聚焦成像尼普科夫）性質。*后，成本高，采購和經營的多用戶共聚焦顯微鏡系統，其范圍可以高達幅度高于可比的寬視場顯微鏡的順序，往往限制了他們實現在較小的實驗室。這個問題可以容易地克服由成本分攤顯微鏡系統服務的一個或多個部門的核心設施。*近推出的個人共聚焦系統競爭力的驅動低端共聚焦顯微鏡的價格，并增加了一些個人用戶。