徠卡顯微鏡：選擇你的激發波長
熒光壽命成像顯微術（FLIM）被廣泛應用于蛋白質相互作用量化測量FRET（福斯特共振能量轉移）發生的兩個熒光基團之間的間隔由幾納米。FLIM也被用來在大陣列的應用范圍從組織成像熒光探測環境。雖然時間相關的單光子計數（TCSPC）熒光壽命定量方法的選擇，它要求包括：i）一個脈沖激光源，2）光子計數卡，及iii）一個快速檢測的專用儀器。這種技術要求呈現TCSPC收購很難執行和/或縮小選擇可用熒光。
徠卡TCS SP5 X克服了這些限制，因為它結合了脈沖白光激光（WLL）的*快光電倍增管（PMT），允許可調光譜檢測。該系統是高度靈活的和用戶友好的FLIM的實驗。在本文中，我們說明了它的潛力，兩個生物應用：交互研究和自發熒光多光譜成像。
技術說明
20世紀90年代中后期以來的首份報告的光子晶體光纖產生*備受關注。它允許相干白光生產抽高非線性光子晶體光纖的*短激光脈沖（或皮秒）。由于其廣泛的光譜，這個源常用的光譜和它*近還實施商業顯微鏡系統：徠卡TCS SP5 X.
配備了一個聲光光束分束器（AOBS），這個系統提供了一個很容易調諧范圍為470至670nm的脈沖激光光源，允許在其*大吸收激發的熒光基團的大面板。為了確定，WLL是否是一個合適的來源FLIM的實驗，我們運行校準基于雙光子FLIM的測量驗證協議。值得注意的是，我們測量系統的儀器響應函數，得到的半峰全寬為約300 ps的，**兼容細胞和組織中的熒光壽命測量的。然后，我們測試的能力FLIM的應用兩大領域：我）相互作用的研究FRET及ii）組織的自體熒光成像。要解決這兩種情況下，我們采用了以下的實驗條件：
使用徠卡TCS SP5 X焦和內部PMT進行終身收購。光子計數使用的貝克爾和Hickl的SPC830卡和SPCImage的生命周期分析是用于執行。
兩個激勵源用于FRET測量：卡默萊昂ULTRA2鈦寶石激光在920納米（8分子量：客觀回到瞳），在488 nm和WLL。檢測通之間設置500和540 nm和300秒的采集時間。
對于convalaria截面成像，我們還使用了兩種不同的激發源：405脈沖激光二極管和WLL。激發和檢測通報告中的第三個數字。采集時間設置為60秒每幅圖像。
圖 1A：非線性光子晶體光纖橫截面
圖 1B：白光光譜Leica TCS SP5中的X（AU）上測得470和670納米之間。
多功能性FLIM-FRET實驗
Leica TCS SP5中的十列出一個脈沖的WLL和*快探測器光譜選擇。我們開發的系統，還配備了一個光子計數卡（SPC830，貝克爾和Hickl等）和鈦：薩激光（變色龍ULTRA II），一個國家的**的源TCSPC實驗。FLIM的特別適用于可視化和測量FRET發生在納米尺度的組織或細胞之間的相互作用的蛋白質。因此，為了驗證作為源FLIM的WLL，我們進行的TCSPC實驗正面和負面的FRET引用交替使用Ti：Sa和WLL作為激勵激光源在同一細胞。正如圖2中所示，兩個激勵源提供一致的結果，并允許定量的熒光共振能量轉移測量。WLL可以被用來作為一個多功能的源FLIM的FRET實驗。此外，在TCSPC模式的壽命精度直接依賴于獲取的光子的數量。在使用本系統時，我們可以優化收集光子的數目由i）優化激發波長的熒光基團的*大吸收和ii）選擇了理想的檢測范圍內沒有，受體熒光bleedthrough的*大供體發射。
圖 2：既負（MB-EGFP）和陽性（MB-EGFP-mCherry）FRET參考使用WLL或鈦：薩激光熒光壽命成像。使用40倍，1.25 NA油浸目標進行收購。比例尺：40微米。
多光譜壽命成像顯微鏡（MSLIM）
結合的AOBS和光譜使用內部的PMT的選擇，該系統允許同時就激發和發射波長選擇的通用性高。如前所示，相關的光譜和壽命測量（纖細）是一種很有前途的技術和**的歧視多標記的樣品和檢測分子間的相互作用內部異質性和自體熒光媒體，如組織。一個WLL的使用進一步擴展的可能性的研究復雜的熒光信號。事實上，人們現在可以執行多光譜的壽命成像的顯微鏡（MSLIM）通過調整兩個激發波長（WLL，通過AOBS）和觀察范圍（移動的狹縫前面的內部PMT）。在這里，我們提出了一個例子自發熒光MSLIM使用固定convalaria幻燈片。
圖 3：連續熒光壽命成像的convalaria橫截面采用各種激勵（灰色條）和觀察（虛線框）波長窗口。勵磁實現使用的WLL，除了在405 nm的激發，這是通過使用脈沖激光二極管。使用了10倍，NA 0.3干目標進行收購。比例尺：500微米。