奧林巴斯顯微鏡：熒光顯微鏡攝影的錯誤

顯微攝影在熒光照明條件下，提出了一套獨特冒充顯微鏡的特殊問題的情況。曝光時間往往是非常長的（在某些情況下運行多少秒到幾分鐘），試樣的熒光可能會在曝光過程中褪色，全黑的背景往往在不經意間光信號米建議過度曝光。

此外，熒光的標本發出他們自己的光，和顆粒位于所需的焦點平面的上方和下方往往輻射光造成圖像細節模糊。盡管熒光圖像可能會顯得明亮時，通過顯微鏡目鏡（由于人眼對光線的敏感度的精致），它們通常需要較長的曝光時間，以注冊令人滿意的圖像，在膠片上。很長的風險，復雜的顯微攝影與熒光染料染色的標本增加振動和電影互惠故障影響，造成不良的顏色變化，在圖像的可能性。

雖然熒光顯微照相術的基本問題，通常是到達膠片的光很少，也有一些可以采取的步驟，以提高圖像質量。用于熒光顯微鏡的物鏡應該具有盡可能高的數值孔徑，實驗中采用的波長的光具有高透射率。由于光強度（反射光的熒光）的數值孔徑的四次方變化，這些目標可以顯著減少曝光時間在反射光中的熒光顯微鏡。光照強度也放大倍率的平方成反比，導致總放大倍數在膠片上保持到最低限度時，明亮的圖像。減少在膜平面上的倍率通常的低倍率照相目鏡的（或投影透鏡）的協助下使用。此外，當使用一個三目頭時，通常是可取的相機轉移所有的光，而不是有觀看目鏡和相機之間的光分裂（通過一個分束器）。由于圖像強度膠片平面的距離的平方成反比，顯微鏡有更好的表現，那么這個距離盡量短。出于這個原因，由于廣泛可用的，大多數熒光顯微鏡被記錄在35毫米的薄膜（而不是更大的格式），當使用傳統的顯微攝影來捕捉圖像。現代低噪聲溫度控制CCD的數碼相機正越來越多地用于取代膠片作為介質的首選熒光顯微攝影。

低光照水平和熒光樣品的褪色是兩個的主要困難需要克服的熒光顯微照相。通常情況下，動態熒光制劑性質使得良好的顯微攝影必不可少的捕捉與樣品發生的事件的記錄，往往可以揭示細節不明顯檢查時通過目鏡觀察標本。長時間曝光，所以常用于熒光，必然導致標本的熒光強度在長時間照射互惠失敗和衰落。事實上，衰落特異性熒光特性往往是速度比背景，從而導致圖像的對比度的損失。

遭受稱為倒易律失效的效果當超過或長或短的時間內暴露在光線下時，所有的感光乳劑（包括黑白，彩色負片，彩色透明膠片）。倒易律涉及圖像的曝光時間和光強度的密度，使得存在在顯微鏡的照明強度之間的相互關系和膜所需的曝光時間。實際上，法律規定的曝光時間，以維持一個恒定的膜密度光強度成反比。光的強度較低，所需的曝光時間越長須交出了一份令人滿意的圖像。這種反向關系成立，對于大多數膜，如果適當的曝光時間是1/500之間的第二個和1/2秒。

在熒光顯微鏡，常規要求低光水平超過1/2秒（通常從幾秒到幾分鐘不等）的風險。互易關系不再持有在這些條件下，膜將需要額外的曝光時間，以得到合適的圖像密度。這種現象被稱為互易律失效，一個術語，它僅表示曝光時間和光強度之間的線性關系不再成立，并不表明薄膜乳液在性能方面的故障。

倒易律失效的一個副作用是，本已疲弱的樣品熒光進一步減少通過漂白的標本，和不正確的色彩再現，經常出現由于為增加曝光時間。圖2中的圖像是該系列的熒光顯微照片，示出抗體熒光標記與當前流行的試劑，熒光素-5 - 異硫氰酸酯（FITC）時，成像的使用奧林巴斯WIB長通熒光立方體。的中心（圖2（b））中的單元格被拍到使用校正后的曝光時間調整為倒易律失效和柯達雷登顏色補償濾波器，以除去不希望的色移。在左側（圖圖2（a）），在同一視場顯示光漂白或褪色，由于長期暴露在照明源的熒光活性的影響。圖2（c）中的顏色變化和縮小圖像的強度，從而從倒易律失效是顯而易見的。

互易律失效，通常可以簡單地通過黑白膠片的曝光時間或加工條件中增加補償，但是這并不總是與彩色負性和透明度薄膜的情況下。大多數彩色膠片有三種顏色敏感的染料層，其中每一個有一個稍微不同的特性曲線的位置和斜率在不同的反應中得到的互易效應可能造成不希望的顏色的變化或管型。通常情況下，暴露時間和色彩平衡過濾器使用彩色膠片時，必須進行調整，以補償很長或短的風險。

利用一個物鏡的，具有一個非常小的數值孔徑（例如，40倍的物鏡NA = 0.65，相對于相同的放大倍率的物鏡具有一個數值孔徑（NA）為0.85，0.95，或1.0）產生一個圖像顯示的亮度不足，因而延長的曝光時間。數值孔徑是一個客觀的集光能力的措施，這意味著高數值孔徑物鏡可以捕捉更大數額的生色團所產生的微弱的熒光發射。做熒光顯微攝影時，務必使用可用的最高物鏡的數值孔徑。使用過度的目標和照相目鏡倍率也將導致亮度降低。為了彌補這一點，總是采用盡可能最低的倍率照相目鏡的和最高的數值孔徑物鏡，在一個給定的倍率。例如，一個60倍俯視復消色差透鏡物鏡具有的數值孔徑為0.95（亮度指數= 22.6），優選的數值孔徑等于0.85（亮度指數= 14.5），即使工作距離的螢石物鏡是一個60X平場螢石物鏡的兩倍，復消色差透鏡。此外，由于高數值孔徑的物鏡的景深較淺的，它們的使用可能避免對比從上方或下方的焦點平面減少聚焦排放的影響。同樣的，一個的2.5倍照相將提供更多的照度大于3.3倍或5倍的目鏡。激光掃描共聚焦顯微鏡是專為從根本上消除了聚焦光，并給予更清晰的熒光圖像分辨率稍好。

如細胞生物學和醫學診斷領域中的典型的熒光應用不僅關注的試樣的亮度，而且具體試樣的熒光的特性的背景熒光的比值。單分子熒光事件和其他低光實驗自發熒光和/或內部反映內部物鏡的能力產生巨大的差異，圖像小的結構與熒光量子產率較低，這一點尤為重要。為了最大限度地提高在設計用于熒光顯微鏡的物鏡的信號 - 噪聲比（試樣的熒光強度高于背景），制造商使用石英等特種玻璃的配方中具有高的透射率從紅外到紫外的整個頻譜。這些物鏡是非常低的自發熒光，利用特殊的光學水泥和防反射涂層，旨在通過熒光激發波長的擴展范圍。更高的數值孔徑耦合到先進的玻璃配方，提供現代化的熒光物鏡的能力的波長處激發標本下降到340納米的光具有更高的傳輸值，以獲得更明亮的熒光圖像。

共同的放大倍率及數值孔徑的的名義物鏡亮度值的比較示于表1。這些數值是根據下列公式計算：

其中，NA是物鏡的數值孔徑和傳動比被推定為100000。從這個等式中，很明顯，對于相同的放大倍率，圖像亮度的照明場和次級熒光隨物鏡的數值孔徑，而且隨著放大倍數的增加而減小。盡可能從標稱值的5-10％的實際數值孔徑為一個特定的物鏡和放大倍率值可能會有所不同。如上所討論的，是由物鏡發送的面板亮度，也依賴的內部結構參數，如玻璃透鏡元件，內部反射和眩光，和鏡片涂料的數量。通常，它是要犧牲比較高的復消色差透鏡物鏡增強后的圖像顯示的亮度更高的數值孔徑的螢石物鏡訂單中的校正色差的光學矯正。

使用高數值孔徑聚光鏡盡可能透射光熒光，以避免光損失和隨附長的曝光時間。此外，當使用舊顯微鏡臺下鏡，購買有一面鏡子，鍍鋁表面，而不是一個鍍銀鏡（銀會反射紫外線光很差）。通常情況下，暗視野聚光油浸可以被取代的標準明場冷凝器發送熒光應用。當使用浸油，適用于非熒光的油狀物之間的頂部的聚光鏡和底部的顯微鏡載片上透鏡和物鏡前透鏡和蓋玻片之間。這種類型的油都是現成的從商業廠商數量。

漂白，或染料的光解，迅速 降低熒光探針用于染色標本和編制暴露最低照度水平是可能的，應盡量減少。這種效應是由于主要是由光動力之間的熒光染料和氧的相互作用，其中涉及促進從單線基態，稱為系間竄越的處理相對長壽命三重激發態的染料分子。一旦已經被提升到激發態的發色團，它變得更加化學反應，并可能參與不可逆的化學反應，包括分解，聚合，氧化（主要由單重態氧）或與另一個分子反應。與氧氣的反應通常會導致漂白發色團，這取決于細胞內的單線態氧的濃度和其他內部的細胞成分，如蛋白質，脂質，或小分子的生色團接近。計算表明，可以產生單線態氧以上的距離超過500埃生色團的光解。

光漂白的影響減到最小，熒光顯微鏡，可結合其他技術，都是非破壞性的熒光染料，如微分干涉相差（DIC）的，霍夫曼調制對比度（HMC），傳送暗場照明，相位相反的。我們的想法是找到感興趣的特定區域的樣品中的非破壞性的對比度增強技術，然后，不不確定試樣的情況下，切換顯微鏡熒光模式。這種類型的一個典型的實驗的結果示于圖3和4中。圖3（a）示出了使用相位對比光學成像的3T3成纖維細胞的單層組織培養。細胞行成立由美國國立衛生行瑞士小鼠胚胎細胞，這是高度接觸抑制和有用的研究，涉及形成肉瘤病毒和白血病病毒傳播。的顯微照片，圖3（b）顯示了相同的視場，但是這一次成像，使用熒光照明（汞蒸氣燈和一個奧林巴斯吳過濾器立方體）的細胞染色的熒光染料4'，6 - 二脒基-2 - 苯基吲哚（DAPI ），具有最大發射波長在461納米，這是用來選擇性地染色細胞核和染色質的核酸特異性染料。圖3（c）示出這兩種技術的組合使用，以產生熒光染3T3細胞核的成纖維細胞的細胞膜和細胞器內部的相位對比度的圖像疊加在一個美麗的顯微照片。此圖片是記錄一個專門的螢石物鏡相環的設計允許同時觀察熒光和相襯的物鏡是一致的。

又如各種技術的綜合，使用微分干涉相差（DIC）的這段時間，如圖4所示。（a）是圖4中所示的薄邊的隱球菌感染的貓的腦組織，想像使用DIC的光學和一個全波的相位差板。注意偽三維外觀的顯微照片。圖4（b）示出相同的視場，但成像熒光照明和一個奧林巴斯WIB過濾器立方體。圖4（b）中的細胞進行染色與熒光素-5 - 異硫氰酸酯（FITC）和剛果紅（發射波長分別為520和614納米，最大值）的組合。這兩種技術的結合使用，以產生圖4（c），它示出了感染的貓的腦組織中的熒光和DIC照明。

光漂白的速度取決于幾個因素，包括發色團的化學反應性，細胞內的化學環境，和激發光的強度和波長。一些熒光染料易于漂白，而有些則是相對不敏感，穩定更長的時間。在許多情況下，試樣可以恢復的漂白效果，尤其是當它是保持涼爽，在黑暗的環境。漂白應區別于另一個熒光工件稱為淬火，發生了競爭過程，如高溫，高氧氣濃度的鹽或鹵素化合物的存在下，分子聚集的熒光強度的降低（或在某些情況下，增強）。有時身體的能量轉移到其他受體分子居住的淬火結果激發熒光染料，這種現象被稱為共振能量轉移。這種特殊的現象已成為一個較新的技術，測量距離遠低于在光學顯微鏡的橫向分辨率的基礎。生色團中的雜質也可能降低熒光強度由漂白或淬火。

漂白可以最小化通過減少曝光時間（如上文所討論），或通過降低能量的激發（燈的亮度），但這些補救措施都伴隨著的不良影響減少了發色基團的熒光發射能量。中性密度過濾器可以被放置在光路中，光到達之前激發光濾光片，從而減少激發光的強度，并減少試樣的觀察過程中的衰落的影響。許多熒光顯微鏡都配有一個快門系統耦合到中性密度濾光片，使激發光強度降低觀察和標本操縱期間，但使顯微鏡可以輕松地切換到全功率照明顯微攝影。這也有利于在可能的情況下，去氧標本（但不是活細胞或組織），如?酸丙酯和其他市售的抑制劑，其為使用特定的抗淬滅試劑。能淬滅單線態氧的化學品也可以減少漂白的效果。的例子是2 -巰基乙胺，1,4 -二氮雜雙環-2,2,2 -辛烷（DABCO），diphenylisobenzofuran，p -苯二胺的，和氨基酸的組氨酸。衰落的影響也可以被降低，在某些情況下，通過改變安裝介質的pH濃度。

圖5（a）示出了幾種市售的抗淬滅試劑的熒光衰落抑制率。藍色曲線顯示未處理樣品熒光強度迅速下降，而紅色和綠色的曲線表明抗淬滅試劑略有不同效率的衰減率減少。標本是有袋類腎組織培養細胞（PTK2）與任一熒光素-5 -異硫氰酸酯（FITC）或羅丹明鬼筆環肽（兩種染料具有類似的衰落特性）染色。抗淬滅試劑分別為p -苯二胺（綠色曲線）或n -丙基沒食子兒茶素沒食子酸酯（紅色曲線）。試樣二次熒光衰減率通常取決于使用熒光染料的不同而不同，即使在相同的條件下觀察。為特定的應用提供具有最低的衰落速度選擇熒光染料，可以通過以下方式獲得了最好的結果。這個概念示于圖5（b）三種熒光染料若丹明（黃色曲線）的花青染料Cy3（紅色曲線），FITC（綠色曲線），其中比較有袋類腎細胞衰落速度的差異。若丹明，一個無處不在的染料有許多應用程序，顯示一個非常緩慢的的褪色速率（圖5（b），黃色曲線）在這些條件下是最好的熒光染料在使用本系統的顯微攝影。

為進一步減少衰落，最好是在一個領域內的試樣進行初步觀察，然后快速移動到“新鮮”字段以曝光之前。這種做法可能會有助于規避漂白和/或褪色效果。這也有利于做到既在部分黑暗的房間環境的觀察和顯微攝影。雖然化學方法和細致的顯微鏡可以減少漂白，最有效的補救措施是提高檢測靈敏度（加上激發能量減少）使用微光CCD數碼相機專為熒光顯微鏡。

漂白的發生，導致被稱為FRAP，這是一個縮寫，漂白后熒光恢復的技術。這種技術是基于激光短脈沖串和隨后的恢復引起的熒光染料擴散到漂白區域的熒光觀察漂白時。

阻擋過濾器的設計，吸收特定波長的激發輻射的反射或傳輸，試樣，并且只發送選擇的可見光熒光。屏障過濾器的截止波長范圍內是至關重要的，因為在許多情況下，它必須能夠發送不遠處值用來照亮試樣的激發光的可見光的波長。因為膜是非常敏感的紫外和可見光波長在380-450納米的區域，它是特別重要的屏障過濾器阻止在此范圍內的所有不想要的波長。更短的波長，以保證除去額外的紫外線阻斷過濾器，如柯達雷登過濾器數字2A，2B或2E，應加入的光學路徑。所有這些濾波器完全吸收紫外線，但其較低的波長可見的藍色光的吸收有少許差別。補充紫外線過濾器的主要屏障過濾器之前，應放置在光路中，以阻止輻射可能誘發自體熒光的主要屏障過濾器，特別是如果這種過濾器是黃色，橙色或紅色。如果阻擋過濾器切斷的頻譜在太長的波長，試樣的熒光顏色將受到影響，并可能會受到影響，尤其是當只有通過過濾器的長波長部分的透射熒光圖像的光線強度。

熒光顯微攝影的色彩平衡中的錯誤，可能有許多的起源。圖6中的顯微照片示出了一些問題時，從自體熒光和不正確的過濾過程中出現的顏色退化的熒光照明下的成像標本。樣品是單層成纖維細胞在組織培養中生長和彩色與7 - 氨基-4 - 甲基香豆素-3 - 乙酸（AMCA），明亮的紫外線興奮的染料共軛體的發光波長為445納米的最大（在短期波長藍色區域）。AMCA的最佳激發波長為345納米的，這需要通過一個顯著量的紫外光的激發濾光片。在適當條件下的照明和過濾，出現染色標本染色細胞核和細胞質部分豐富的和深藍色的顏色（用Olympus吳濾波器的多維數據集的成像），圖6（b）所示。當太多的紫外線光通過的屏障過濾器被使用時，一個藍色的演員和背景顏色經常是存在的試樣（圖圖6（a）所示），次級熒光顏色的顯微照片中的退化。配售輔助紫外線和/或短的藍色波長屏障過濾器，在顯微鏡的光學路徑的某處，是緩解這一問題的首選方法。

用熒光染料染色的標本往往會產生不希望的量，特別是短波長的藍色自體熒光染色組織切片。正如上文所述，該自體熒光必須被吸收的屏障過濾器，以避免二次熒光發射的熒光染料標記的試樣所產生的降解。柯達雷登濾波器2A和2E，吸收短波長的藍色輻射，是適于在本申請中使用。顯微鏡制造商和售后市場供應商也提供微調截止屏障過濾器的過濾器非常有用。

安裝媒體的內在的自體熒光，也可引起不同的問題與圖6（a）中所示的顯微照片。許多流行的永久安裝的培養基配方表現出不希望的副作用的自體熒光，并且不應該被用于熒光定量工作。相反，臨時裝片用純甘油，甘油 - 水混合物，或無熒光浸泡的油被用來制作標本。顯微鏡制造商提供專業的光學矯正的目標，這些目標的標本觀察甘油。自體熒光產生的安裝媒體通常為淡藍色或綠色，并會導致退化的二次熒光標本。如果屏障過濾器不會刪除多余的安裝媒體所產生的自發熒光，有時柯達雷登色彩補償濾鏡可以添加的途徑來緩解這一問題。（黃色）CC20Y通過使用一個過濾器，例如，可以除去大多數媒體所產生的淡藍色和淡綠色熒光可以與CC20M（品紅）濾波器中。使用更高密度的過濾器（CC30及以上），往往會導致二次熒光吸收。

自體熒光的細胞和組織文化展出往往能限制的能力來檢測熒光探針在染色和固定制劑。固定的組織所顯示的自體熒光的程度往往會有所不同，這取決于樣品制備和使用的實驗條件下檢測熒光。黃素輔酶（FAD和FMN）和減少吡啶核苷酸（NADH）在哺乳動物細胞中的自體熒光的主要來源。二次熒光熒光染色植物細胞往往掩蓋了自發熒光木質素（綠色自發熒光），如葉綠素（紅色自發熒光）和卟啉。有時可以克服這個問題可以與固定的細胞和組織的0.1％的溶液與硼氫化鈉的磷酸鹽緩沖生理鹽水30分鐘染色前徹底清洗。

當用于染色標本的發色團的波長的吸收和發射光譜的激發和/或發射波長的濾光片不匹配，則次級熒光通常會受到影響，如在圖6（c）所示。在此示例中，一個不正確的發射具有過短的波長截止濾波器被用來傳遞由樣品發出的熒光二次。因為大多數的這種熒光的光譜在藍色區域（455納米）為中心，只有泥濘的紅長波長的色調通過過濾器。要更正此問題，一個新的障礙，應選擇過濾器。彩色膠片曝光過度，可以沿著互惠的錯誤，也會造成最終圖像中的二次熒光顯著的顏色變化。

對比度錯誤經常出現配置錯誤或錯誤的過濾器組合使用時，在熒光顯微鏡，光學顯微鏡火車。這些錯誤的幾個在圖7中，這說明所造成的的激發濾光片不當選擇和熒光浸油二次熒光圖像的對比度差。標本是一個橫截面的日本楓樹葉柄使用奧林巴斯全身振動過濾立方體一個的螢石10倍目標進行自體熒光成像。在理想的條件下，在圖7（b）中呈現的圖像，將通過以下方式獲得。然而，當激發光濾光片有太大的帶寬（允許不需要的波長通過），圖像失去的對比結果在圖7中所示的顯微照片（一）。選擇正確的過濾器的組合，需要了解的發色團（次）用于染色試樣的激發和發射光譜的值。在這種情況下，激發光濾光片通過波長550納米，由試樣發出的熒光，并嚴重地影響圖像的對比度與綠色二級干擾。

控制在熒光顯微鏡標本的對比需要，所有光學元件的自體熒光的顯微鏡，他們不應該顯著程度的散射光。這包括內部的玻璃鏡片，鏡，過濾器，和分光鏡。目標應提供高的圖像質量，同時高效率地傳輸光下降到近紫外范圍內。過濾器必須發送所需的波長，同時阻止其他可能會干擾觀察二次熒光。因為激發光比樣品熒光強度大得多，完全消除這種光的熒光圖像的任務是不是很容易，需要仔細選擇激發波長范圍窄（通常為10至75納米的過濾器組合提供帶寬）。當使用高數值孔徑的浸沒目標時，至關重要的是，浸油污染物，可能會表現出熒光。圖7（c）舉例說明了自體熒光浸油產生的對比度差。盡管浸油的使用有助于提高圖像的亮度，部分地通過消除不確定的光的損失所造成的反射表面（特別是，蓋玻片和玻璃透鏡元件），熒光誘導自體熒光的混合不需要的波長的污染物，與從二次熒光標本。這有增亮的同時，降低了圖像的對比度，這兩者都是不希望的背景的不幸結果。

文物在樣品制備，也將產生對比的問題，在熒光顯微鏡。早期的先驅熒光常常利用非特異性的熒光染料，由于這樣的事實，染料分子被隨機地分布在整個試樣的非常明亮的圖像。新的改進和高度特異性的熒光染料的熒光技術已導致染色的目標地區，具有明顯弱于熒光染料結合少得多，因為標本展出。這些新的方法，需要更仔細的樣品制備，以避免不必要的熒光文物。染色前部的非熒光染料中的檢體競爭結合位點的選擇性熒光染料，以幫助它往往是有幫助的。標本應徹底清洗，除去未結合的熒光，放置在酸前清洗玻璃非熒光顯微鏡載玻片。通過加入化學添加劑，以減少光漂白的熒光染料的環境中優化有助于減少或消除試樣衰落。此外，重要的是仔細選擇安裝介質的化學成分和pH值，以獲得最佳的圖片，次級熒光。也應該是無熒光的蓋玻片和浸油，如上所述。

自體熒光和/或試件的固有特性的結果，或通過染色中的錯誤可能會發生非特異性熒光。典型的這種類型的錯誤在圖8（a）中示出，其示出了大鼠結腸組織染色的薄截面的混合物的熒光素-5 - 異硫氰酸酯（FITC）和4'，6 - 二脒-2 - 苯基吲哚（DAPI） 。在顯微照片的整體偏藍是由于自體熒光和非特異性熒光的組合，由于與DAPI熒光染料overstaining。適當的兩種染料染色，然后徹底洗滌后的試樣的結果列于圖8（b）的顯微照片。類似于圖8（a）中所示的錯誤所造成的使用太廣泛的激發帶寬，可以得到糾正，有較窄的帶寬的使用的過濾器的一個可逆的錯誤。另外，激發濾光片的組合可以有選擇地產生一組特定的波長，或屏障過濾器可以進行調整，以通過只有較長的波長。圖8（c）顯示大鼠結腸薄切片染色時正常，但現在缺乏一個紅色在光學通路抑制濾波器引起的淡紅色背景。這個錯誤可以被放置在光路中的適當的抑制濾波器校正。

熒光顯微攝影還患有其他形式的光學顯微術和顯微攝影遇到的常見問題。這些措施包括光學和膠片平面，顯微鏡立場振動，灰塵和碎片的污染，曝光不足，曝光過度，色彩平衡錯誤，鏡面反射（常見的長時間曝光和架空室內照明）之間的焦距調整不當引起的聚焦誤差，漸暈，和光學顯微鏡誤配準。這些錯誤的例子在我們的一節題為“ 熒光顯微攝影與彩色投影膠片的錯誤，在顯微攝影節的奧林巴斯顯微鏡資源中心顯微鏡底漆。

熒光顯微攝影的相機和膠卷 -薄膜技術的改進提高膠片的速度和分辨率的改善，但也有沒有彩色膠片目前唯一適用于熒光顯微攝影。單獨的彩色膠片的特定屬性，包括單獨的乳劑層的特性曲線屬性耦合的染料，和用于熒光激發和發射的光的光譜響應往往相差很大，從膜膜，有時很難控制和再現。這些問題導致難以維持準確的色彩渲染和曝光使用膠片的彩色顯微攝影。

是復雜的熒光的標本的亮度范圍內的事實，通常遠遠大于可準確地記錄在膠片曝光測量的熒光顯微照相。過分的亮點，將導致失去精致的細節和色彩飽和度，曝光不足而產生很暗的圖像不顯示功能，隱藏在陰影區域。要么過度或曝光不足的背景下，這通常是非常暗色或黑色的，不作為關鍵。三種主要方法被利用，以確定曝光時，使用熒光性：亮度測量的CCD，光電二極管或光電倍增管，在曝光過程中連續測量（光電倍增管），和最不理想的方法，試驗和錯誤。設計用于熒光的的現代顯微攝影系統的設施的能力來衡量的照明強度，并計算基于該讀取的曝光時間。對于常規熒光顯微攝影，有些相機有決定曝光時間硅藍色探測器的細胞，而另一些光電倍增管計量探測器測量極其微弱的標本。

重要的是要考慮幾個因素，在選擇的檢測器系統用于熒光顯微攝影。這些包括檢測器的噪聲電平的信號與噪聲之比的圖像，空間和時間分辨率，幾何失真，線性度，和光譜靈敏度。在確定正確的曝光熒光標本，最好是使用相機的CCD或光電倍增測光系統，能夠精確的低光測量。點測光的能力是有價值的實際測量面積的熒光，沒有不想要的測光通常黑暗的背景包圍的熒光的材料。另一種技術涉及到使用的曝光調節控制，以減少曝光時間，否則將被過分延長測量的視場的黑暗背景。在這方面，奧林巴斯和尼康相機有內置的算法，減少暴露，如果將相機設置為熒光模式。當光線不足的（通常大部分的時間用熒光），設置發送所有的光三目棱鏡膜面減少曝光時間。

在理想的情況下，點測光應包括顯微攝影系統，以幫助確定曝光時只有幾個明亮的物體是可見的，否則黑暗的背景上。在整個視場對于集成光測量的，沒有點測光，曝光時間應削減一半或計量讀數的四分之一（在一個黑暗的背景上分散的熒光物體），暗視野顯微鏡的情況很像。如果點測光的光傳感器是在一個固定的位置的視在中間，試樣必須首先被移動到視野中心，以獲得合適的曝光測量的區域，然后移往組成的顯微照片。高端相機系統允許翻譯點測光傳感器，使顯微鏡曝光測量前確定顯微照片組成。定位后的試樣進行顯微攝影，點測光傳感器可以被移動到最亮的區域曝光測量的視場中，不影響試樣。當使用點測光，使熒光物體一定是大到足以填補當場記錄準確的曝光讀數。

一些顯微攝影的攝像系統提供一個永久的上演的光的一部分的分束器組件，光度計，它允許在實際曝光過程中的光測量，以補償衰落。這是一個方便的方法來調整曝光時間，以避免光漂白工件的飛，但它的缺點下減少向膜的光強度，因此需要更長的曝光時間。更先進的計算機輔助攝像系統能夠方便地存儲在計費系統的存儲器中的預編程的查找表，以補償通過互易律失效和衰落。倒易律失效的相機系統電腦自動修正工作將根據以下公式來計算曝光：

T_c是校正后的曝光時間，T _m是計量時間（未校正）， 和p是從安置在系統的查找表的單個膜的互易值確定的常數。此系統是有限的數量和類型，計費系統的初始編程過程中被添加到查找表膜的互惠數據。

沒有的整體測光系統，確定曝光時間必須由試錯。此方法涉及在不同的曝光時間，通過加強遞增一個半到一個完整的f制光圈（包圍）的一系列的試驗曝光。處理后的電影，曝光，產生最好的結果仔細說明，并提供進一步的顯微攝影使用相同的顯微鏡配置的基礎。標本的照明或顯微鏡設置的更改將需要另一系列的曝光括號來確定新的最佳曝光時間。如果只的物鏡放大倍率改變時，新的曝光時間，可以計算出與先前記錄的括號數據。許多顯微攝影做熒光顯微鏡支架的風險，無論是過去，由三個或更多的時間間隔下，做出一定的，他們將爭取在一個正確的曝光設置。保持良好的書面記錄曝光及相關設備的數據可以減少或消除需要未來的包圍。決定曝光時使用的試驗和錯誤的方法，它是明智的連續監測顯微鏡燈泡輸出偏差照明燈老化發生。使用這種方法確定曝光的顯微鏡往往依賴于單反相機拍攝以熒光照明。有了這些相機在曝光過程中快門和取景鏡，運動可能會引起振動，導致不清晰的圖像。此問題通常可以通過使用遙控快門開關和/或提高反射鏡前曝光規避。在某些相機，自拍定時器操作的發行的反射鏡，它允許振動停止曝光之前的時間。

顯微鏡配備專門為熒光照明往往有在系統或照明系統的分劃板調焦望遠鏡，使顯微鏡可視化顯微照相光柵疊加在隱約可見標本靠住一個非常黑暗的背景。奧林巴斯和尼康都在他們的高端顯微鏡，提供了選擇的十字線和電影幀顏色查看標本提供光罩。顯微鏡可以選擇紅色或黃色的照明分劃板。紅色的光環維持觀察者的眼睛的暗適應具有的優點，在藍色和綠色的二次熒光觀察時，提供了極好的對比度。對于紅色熒光并同時相襯或DIC時，應選擇黃色標線片，以最大限度地提高對比度。一些制造商提供了一個與照明取景光罩，調焦望遠鏡自動相機外殼的重視，并允許在黑暗背景場的拍框尺寸觀看。

當選擇膜熒光顯微攝影，電影速度（ASA或ISO等級）是一個變量，應慎重考慮。ISO等級越高，在其他條件相同的情況下，要登記在膠片上獲得滿意的圖像的光量越少。熒光顯微鏡中使用的照明光源需要日光平衡的膠片乳劑準確地呈現標本二次熒光顏色。大多數主要的電影制造商提供了廣泛的日光片在不同的ISO評級透明度和彩色負片格式。柯達日光EKTACHROME柯達克羅姆ISO 200或400或200，都在35毫米大小，正面的透明薄膜，顯示足夠的速度，良好的色彩還原和接受的解決辦法。提供FUJICHROME PROVIA在400和1600的ISO等級，是一個極好的透明膠片的色彩飽和度和分辨率方面。其他廠家做比較透明膠片，但我們建議避免使用彩色負片，如果在所有可能的。

對于黑白膠片，柯達提供了T-MAX 400，中粒膜，這是一個最好的熒光應用的一個很好的罰款。一些黑白膠片標準彩色負片化學品（**1）可以處理。其中包括T-MAX 400CN，柯達KODAK ADVANTIX和Ilford XP-2超級，提供所有這一切都是在ISO 400的評級。請記住，更快的膜允許更短的曝光時間的增加晶粒尺寸在犧牲。表2列出了基本的膜的性能，以供參考。

相比之下，在熒光顯微攝影的最關心的問題之一，不僅依賴于顯微鏡的配置，而且還取決于所選擇的膜的物理特性，由熒光染料的發展過程中，曝光的詳細信息，以及檢體本身相對于染色的效率漂白或褪色。顏色透明薄膜可以由一個或幾個光圈值（獎金考慮互惠褪色時）曝光不足，然后將處理在第一顯影劑增加對比度和色彩飽和度的處理時間延長。許多黑白膠片可以產生相反的變化，依賴于開發混合條件和處理時間。膜熒光顯微攝影決議確定主要由光學顯微鏡（主要是物鏡的數值孔徑），以及它是如何配置的參數，但也有點依賴電影的特點和發展方式。然而在實踐中，電影的分辨率只有成為一個因素顯微鏡時沒有表現最佳的ISO感光度是如此之高，糧食成為一個因素。

數字成像技術的最新進展，已經徹底改變了捕獲使用電荷耦合器件（CCD）的顯微照片。當成像乘熒光染色標本，數碼相機提供了一個很好的解決方案，并正在迅速成為許多photomicrographers的首選媒體。三芯片集成彩色CCD攝像機的價格已經下降到一個合理的范圍，并耦合到的幀接收器或數字視頻卡和計算機時，提供了一個極好的方法，收集，進行數字化處理，編輯，存儲熒光圖像。

很多標本必須顯示弱熒光高性能CCD探測器規格。目前，最好的選擇是背照式的框架或隔行傳輸設備，它配備了散熱片和/或外部冷卻水庫。這些相機有很多的量子效率接近或超過90％，并允許多個圖像讀出之前的連續收購。從一到五秒鐘運行的圖像采集周期，根據讀出速率，視頻采集參數，CCD分辨率。符合這些規范的一個典型的CCD相機是的光電子 MagnaFire數字成像攝像系統專為科學應用程序。該相機具有3英寸SONY ICX085AL隔行傳輸CCD數組的大小為1300×1030像素尺寸為6.7微米（平方米）。60分貝動態范圍的信號-噪聲比，文件的位深度為24，32或48位顏色，每個像素/秒的有16000電子阱的深度的4個電子的暗電流，并增強了相機的性能密封氣體珀爾帖CCD冷卻。彩色圖像的形成是通過多個光學玻璃分色彩色濾光片。達等廠商也提供了廣泛的適用于幾乎每一個需要熒光和常規光學顯微鏡的數碼相機（如圖9所示），一個典型的CCD相機。

以下幾點總結熒光顯微攝影的重要方面。

• 使用高數值孔徑物鏡配備近紫外光是透明的玻璃或石英透鏡。另外，用最低的放大投影鏡頭成為可能，以限制總的放大倍率。

• 透射光的熒光反射光熒光首選。如果這是不可能配置的反射光顯微鏡，使用透射光的暗視野冷凝器。

• 優化通過仔細選擇膜參數，配置適當的顯微鏡標本的對比，并通過精心選配生色激發適當的激勵和阻隔過濾器和二次熒光性能。

• 從光路取出三目分束器的棱鏡，在曝光過程中，使100％的光到達膠片平面。還可以使用35毫米膠片，避免更大的電影格式。

• 選擇日光平衡透明度薄膜試樣顏色，分辨率和對比度的最佳演繹。推過程的透明度薄膜增強對比度和色彩飽和度。

• 光源必須提供高強度輻射的頻譜很窄的范圍內，一般在10和50納米。最好的選擇是氙氣和汞蒸氣燈或調諧到特定波長的激光。

• 顯微鏡的光學列車，包括透鏡，反射鏡，過濾器，分光鏡，浸泡媒體，顯微鏡載玻片和蓋玻片，應該是免費autofluorescing組件。

• 如果不觀看或攝影熒光標本，阻止激發光漂白，使用過濾器的滑塊或快門照明避免試件破壞。

• 總是提供一個熱過濾器之間的照明器和熒光過濾器，這可能是多余的熱量損壞。

• 監控燈閃爍的跡象，并更換時，光照強度變得不均勻。保持適當的科勒照明燈和垂直調整照明。

• 仔細準備標本染色后徹底清洗并去除多余的發色團。

總之，熒光顯微鏡領域正在迅速擴大，在許多醫學和生物學研究實驗室。熒光顯微鏡的主流已經經歷了一個幾乎完全轉變，從利用透射光入射光，伴隨著許多新的和不同的熒光染料通過引入。這已經促使許多新的和多樣化的熒光顯微鏡應用的動力。