尼康顯微鏡：隨機光學重建顯微鏡（STORM）
所提供的寬視場的多個成像模式中，激光點掃描共聚焦，多光子熒光顯微鏡允許非侵入性的，固定和活細胞和組織中有高水平的特異性生化時間分辨成像。盡管傳統的熒光顯微鏡的優點，該技術在超微結構的調查，由于光的衍射，可以與標準的目標捕獲的信息量限制設置的分辨率極限的阻礙。在過去的幾年中，已經采用了一些新穎的儀器為基礎的方法來規避衍射極限，包括近場掃描光學顯微鏡（NSOM），受激發射損耗（STED）顯微鏡，飽和結構照明顯微鏡（SSIM）和地面狀態枯竭（GSD）。這些技術都實現了改進的橫向（x - y）分辨率下降到幾十納米，更不是一個數量級的下方施加衍射極限的，但每種方法都有一套獨特的局限性。
有限的空間出現在光學顯微鏡的分辨率極限從什么一個多世紀以來被認為是一個基本的物理規律的光聚焦到一個離散點在圖像平面固定。恩斯特·阿貝在1873年首先描述，在顯微鏡的最終解決方案是不受制于儀器的光學質量，而是由光的波長用于收集圖像和孔徑角光學系統。在正式的書寫方式，側向和軸向分辨率限制的數學描述由下面的公式：
Resolutionx,y = λ/2NA (1)。 Resolutionz = 2λ/NA2(2)
其中，λ是照明的透射光或熒光的激發波長頻帶的平均波長。的物鏡的數值孔徑（NA = n?sin(θ)）由成像介質的折射率（N，通常是空氣，水，甘油，或油）的孔徑角的正弦值乘以（sin(θ)被定義）。根據阿貝的理論，圖象由從數組中的衍射限制的點，具有不同強度的重疊，以產生最終的結果。因此，優化的空間分辨率和圖像的對比度的唯一機制是通過減少成像波長，增大數值孔徑，或使用具有較大的折射率的成像介質的衍射限制的點的大小最小化。然而，在理想的條件下，橫向分辨率仍然有限接近200至250毫微米（見公式（1） ）的 相對適度的水平，而軸向分辨率則更差（公式（2） ），500 納米的順序。當試圖高度曲折的圖像的功能，如細 胞器，衍射限制的分辨率表現為不良軸向切片能力，并降低對比度在成像平面上。此外，整體實現三維標本的標本的對比相對較差的軸向分辨率一般是占主導地位的。
已被廣泛使用激光掃描共聚焦和多光子顯微鏡適度提高沿橫向和軸向的軸的空間分辨率，但這些技術仍然有限的方面實現顯著改善。加上針孔限制在共聚焦顯微鏡檢測的聚焦激光激發，在原則上，由1.4倍提高空間分辨率，雖然這只有在信號與噪聲在一個顯著的成本實現。同樣地，多光子熒光顯微鏡利用非線性吸收過程，以減少有效的激發點擴散函數的大小。但是，再次，更小和更精細的點擴散函數被抵消的必要性，使用較長波長的激勵光。作為一個結果，而不是提供顯著改善的分辨率，共聚焦和多光子顯微鏡比傳統的廣角技術的主要優點是減少排放源的焦平面（焦亮），使去除背景信號源自三維容積重建成像方式獲得清晰的光學部分。
雖然近場掃描技術（例如近場光學顯微鏡），可以達到很高的分辨率的衍射極限的光學系統使用的情況下，它們是難以操作的，非侵入性的模式，必須緊跟在試樣表面的地形輪廓，并沒有多大用處胞漿內固定或活細胞成像深。被稱為受激發射損耗，GSD和SSIM 合奏聚焦光成像技術，并基于對非線性光學效果，通常需要專門的調制濾波器的應用程序的多個高強度的脈沖激光激發光束的幾何形狀控制（一種技術通常被稱為點擴散函數工程）。已解決成本過高的脈沖激光器CW-STED系統，實現成本較低的連續波激光器引進。即使能夠實現橫向分辨率在幾十納米測量點擴散函數的修改方案是，這些方法可能會損壞標本激發光水平高，要求耐漂白的熒光探針。此外，他們依賴于高度復雜和專門的顯微鏡配置的平均細胞生物學家難以組裝。
單分子成像
全內反射熒光（TIRF）顯微鏡檢查居住在幾百納米的蓋玻片平面的熒光探針作為一種可行的技術的出現，本方法所提供的單分子檢測能力提供了新的可能性，獲得子衍射分辨率成像。可以收集足夠數量的光子，單發射器的位置可以被確定為幾乎任意精度高。基于這個原則，一個TIRF相關的技術稱為熒光成像與納米精度（FIONA）是第一顯示本地化的熒光探針具有精度高，準確地確定其衍射極限點的中心位置的方法之一擴散函數。不幸的是，定位精度FIONA不直接轉化為超分辨率成像由于這樣的事實，在靠近的多個發射器（將被發現的標記的細胞器或膜）仍然是困難的，如果不是不可能的，要解決的。
一些其他單分子成像技術已聘請獨立的發射器本地化具有精度高。通過施加光，有選擇地去除單個分子一個FIONA相關的稱為本地化納米的多個單分子熒光顯微鏡（NALMS）被證實為解決受衍射限制的區域內重疊的相同的熒光探針之間的距離的技術。同樣地，類似的技術相關的FIONA稱為單分子漂白與高分辨率成像（SHRIMP）利用光漂白緊密間隔的熒光基團中的兩個或更多個順序地從已漂白的最后一個發射器來確定自己的位置。單分子高分辨率共存（鴻業）推出的兩色版本FIONA使用兩個檢測通道之間的受托標記監察注冊。另一項相關調查監測擴散到一個固定的生物目標漂白高分辨率成像的熒光探針的結合，被稱為納米地形（油漆）的成像點積累。不像蝦，NALMS，鴻業涂料不僅限于發射器，就可以解決，隨后將討論與超分辨技術，更緊密的分子密度。其他相關方法涉及利用量子點的基礎上隨機的和可逆的進入黑暗狀態，熒光團的本地化實驗也被分離和本地化基于其光譜的差異。
上述新型的單分子技術能夠本地化個別熒光發射精度高，但他們是唯一有用的探頭時，都非常好密度介乎10至50每平方微米的分子彼此隔離。的相當大的分子間的間距是必要的，以確保可以精確地確定每個熒光團的位置不重疊的發射器的顯著的干擾。此外，單分子的方法，如菲奧娜，NALMS，涂料和蝦都無法識別具有不同的分子機制，使單個發射器的順序讀出從定義一個特定的亞細胞結構的熒光團大合奏。因此，它不是直到重標記的試樣施加兩個不同的熒光發射狀態之間的光控或光轉化單分子（也稱為基于探測的）的超分辨顯微鏡成為了現實。支持基于探測的超分辨成像技術發展的另一個定義是引進微光電子倍增電荷耦合器件（EMCCD）相機系統，有精致的單光子探測靈敏度。
如圖2中所示是一個設計的顯微鏡進行單分子的超分辨率圖像的二維和三維的（這將在下文中更詳細討論）的商業實現。該儀器能夠實現20和30納米和50和75納米的三維成像之間的軸向（z）的分辨率之間的橫向（，）分辨率。單分子成像的軸向范圍為約500納米，并且通過掃描樣品載物臺或目標在?方向，可以進一步提高。注重漂移校正系統，使研究人員能夠保持正確的焦平面進行單分子成像時，在60倍的目標，以100倍的范圍使用水和浸油技術。此儀器的激光器包括50毫瓦405納米二極管裝置，以及個人200毫瓦的固態激光器的光譜線在488，561，647納米的覆蓋范圍通常用于單分子熒光團成像。最后，圖像EMCCD相機連接到顯微鏡控制軟件系統，使用記錄。振動隔離表是需要儀器的穩定性。
單分子超分辨率成像
浮現在四個月內優雅地展示在2006年的順序和隨機讀出多個單分子光開關的染料或光學熒光筆熒光蛋白的熒光標記在密度接近普遍采用的標本的精確定位技術獨立三重奏廣角和共聚焦熒光顯微鏡（高達100,000分子每平方微米）。這些幾乎相同的單分子超分辨成像技術被稱為隨機光學重建顯微鏡（STORM ;見圖1），光敏定位顯微鏡（PALM）和熒光光敏定位顯微鏡（FPALM）。他們依靠在低功率應用激活激光發射開關觸發，所以任何特定分子具有小概率光敏，但大部分的人口仍然在原來的（黑暗或本地的）發射狀態。雖然作為他們最初發表的方法之間的主要區別只是用來實現超分辨成像的熒光探針的性質，這些技術幾乎是相同的。事實上，原困的研究報告提到使用的熒光蛋白，而前掌論述了應用籠合成熒光。
風暴背后的基本原則，，PALM，FPALM，以及相關的方法是，光開關分子的激活狀態，必須引起足夠的光子發射連續使精確定位，然后進入一個黑暗的狀態，或停用漂白。此外，人口稀少激活的熒光分子，必須相隔的距離超過阿貝衍射極限（實際上，大于約250納米），以使并行記錄許多單獨的發射器，每個都具有一組不同的坐標系的橫向圖像中平面。如將要詳細討論的，來自圖像的區域陣列檢測器捕獲的單分子的質心，用于確定是根據發出的光子的數量（參見圖3）用精密的分子坐標。發射器的圖像被捕獲使用一個低功耗的讀出激光（通常是跨越從1到3個攝像頭幀），直到它們自發地光漂白劑或重新輸入暗狀態。對于多周期重復這個過程，每次產生一個隨機活化的熒光基團的獨特的子集，使許多熒光團的位置，來確定和總結在實驗結束后，重建的圖像。
參與創建風暴超分辨圖像的基本步驟，在圖1中使用了一系列的卡通圖畫。圖1（a）中示出的目標結構示出了假設標記的絲狀密集的細胞內結構的網絡，它可表示與微管蛋白和肌動蛋白的單體單元構成的細胞骨架的生物聚合物。在圖1（b）中，一個稀疏的熒光探針被激活以產生單分子圖像（用橙色圓圈）表示不重疊的。后用數碼照相機拍攝的圖像，點擴散函數的單個分子的定位精度高的基礎上的光子輸出前探頭自發光漂白劑，或者切換到暗狀態。本地化分子中心的位置用黑色十字架表示。重復該過程，在圖1（三）通過第1（e），直到所有的熒光探針由于光漂白或耗盡，因為背景熒光變得太高。最終的超分辨率圖像（圖1（g））是通過繪制熒光探針的測量位置的構造。
在20世紀30年代，精度高，單個分子本地化的概念最早是由德國物理學家海森堡更正式的幾個研究小組在上世紀80年代和20世紀90年代解決了堅實的數學基礎。基本上，雖然表現在一個有限尺寸的點具有受衍射限制的尺寸時，與基于CCD的攝像頭捕獲的圖像的一個單一的熒光發射極，可確定了精度與該分子的確切位置可以明顯較高（在幾納米的范圍內），提供足夠的光子被捕獲。這是由于這樣的事實，每個捕獲的光子提供了一個獨立的位置測量的，與最終電平的精度，即總的測量次數的平方根成正比。用于確定分子定位坐標的方法是基于一個統計測量的光子的分布的高斯函數的曲線擬合算法。該練習的目的是要確定的光子的分布（μ），并在安裝位置（不確定性，σ）的標準誤差的平均值，根據公式：
（3）
其中，s是發射極近似真正的點擴散函數的高斯函數的標準偏差， N 是從熒光分子捕獲的光子的數量，一個是成像檢測器的像素尺寸， 和 b 的標準偏差的背景（包括背景熒光結合探測器噪聲）。公式的右手側的平方根符號下的第一項（3）需要考慮到光子散粒噪聲，而第二項包括有限的像素大小的檢測器中的效果。過去長期因素的影響背景噪音進入方程。通過應用這些簡單的技術，可以實現定位精度約10納米時，測得的熒光團的激發光分布是約1,000光子和背景噪聲相比可以忽略不計的分子信號。在后者的情況下，方程（3）可以近似為：
σ ≈ s/√N(4)
正如所描述的方程（3）和方程（4） ，在獲得所需的精確的分子定位STORM成像，以盡量減少背景噪聲的同時，最大限度地提高從熒光探針的光子輸出高精度的結果的最關鍵的元件。本地化的中心在一個最好的情況，如果10,000個光子可聚集在背景上的情況下，前，無論是光漂白的熒光團或關閉時，可確定的精確度下降到1至2納米。然而，由于收集光子數較低，定位精度越來越少。因此，如果只有400至500的光子的測量，準確度下降到約20納米或更壞。背景在暴風成像，從天然的或轉染試劑誘導的自體熒光，以及從殘留要么沒有被激活，或者已經進入了一個暗狀態（但不是光漂白）從鄰近探針的熒光產生。因此，STORM成像的熒光探針的選擇應顯示高對比度，被定義為光活化或光轉換之前和之后的熒光發射的比例。圖3中所示的是一個單獨的光開關探針的定位精度。在圖3（a）所示的圖像檔案中的Cy3標記的Cy5染料對在一個單一的周期，而在圖3（c）從多個激活周期的階段漂移校正后的質心位置的分布。插圖（圖3（b））示出的質心的位置。
風暴的基本概念一個相當大的變化，Palm和FPALM已采用多種激勵計劃及合成熒光基團和熒光蛋白的誘導暗態。因此，直接的風暴（dSTORM）操作到它的父類似的方式，但代替配對photoswitchers的（如Cy3和Cy5），該技術是能夠使用常規的單機硫雜羰花青染料（包括Cy5標記的Alexa Fluor 647，一些ATTO系列熒光團）。引進dSTORM是一個重要的發展，因為它已經成為研究的主要驅動力為開發潛在的新合成熒光光開關與一個單一的激光，可以選擇性地開啟或關閉。同樣，在修改后的技術稱為PALM獨立運行的采集（PALMIRA），數碼相機操作不同步激活激光器或熒光探針的開關周期的高速。PALMIRA需要熒光團要么photoconvertable的或可逆的光開關的應用（無論是合成或熒光蛋白），并大大加快了圖像采集速度提高了100倍。
在其他基于探測的超分辨方法，使用合成熒光最初報道是一種技術，單分子返回（GSDIM），經營成亞三重態駕駛它通過填充一種人工合成的熒光暗態稱為基態損耗其次是發射器的圖像記錄，因為他們隨機返回到基態。許多類似的技術已經出現，充分利用和相關現象，包括閃爍顯微鏡和可逆漂白顯微鏡（RPM），兩個例子，一個看似層出不窮的技術變種托管頻譜的新的首字母縮寫。這些新方法所提供的最顯著的潛在的是，它們是能夠生成使用標準合成熒光探針，如熒光素，Alexa的熒光染料，ATTO染料，的carbocyanines和相似的染料，無論是在簡單的緩沖區的一個子集的超分辨率圖像或耦合到氧拾荒者和脂肪硫醇。然而，這是值得注意的，以產生真正的高分辨率圖像，需要具有非常低的平均時間與關斷時間比的熒光基團，所以在任何給定的時間，只有一小部分的分子被激活。更具體地，約10分子可以定位受衍射限制的區域內，如果平均的通斷比等于0.1。根據奈奎斯特準則（下面討論），這對應于只有50％以上的衍射極限的空間分辨率的改善。大多數傳統的熒光團不表現出合適的比例，激勵探針的發展，更理想的開關性能的研究。
該系列的圖4中偽彩色圖像說明哺乳動物的成纖維細胞腎細胞中的微管網絡的風暴超分辨成像。與多聚甲醛和glutaraldehyle的混合物中的貼壁非洲綠猴腎細胞被固定，處理前的小鼠原代α -微管蛋白抗體包被，然后用5％正常山羊血清。洗滌后，將樣品與山羊抗小鼠第二抗體，以Cy3和的Alexa Fluor 647（Cy5標記的結構類似物，具有相似的光控性能）雙共軛處理。暴風影音圖像生成使用綠色激活激光（532納米）和遠紅外成像激光（657納米）。常規的寬視場的微管中的單個單元格的大面積的熒光圖像示于圖4（a）。在圖4（c）相應的風暴聚集來自同一地區的圖像。白盒裝在圖4（a）的區域放大顯示在圖4（b）在同一地區，使用圖4（d）中所示的風暴解決。注意交織的微管劃定風暴圖像的清晰程度。
STORM成像的熒光探針
適合用于成像與暴風和相關的超分辨率方法的熒光探針是那些具有非常高的亮度和對比度的水平，在光漂白前每分子的光子產生的最大數目，或返回到一個黑暗的，非熒光的狀態。對于所有的熒光基團的摩爾消光系數和熒光量子產率，在理想的情況下應該是100,000和0.75?0.90的范圍內，分別的值，乘以以達到最高的定位精度，相對亮度是由。此外，風暴成像的最佳的探頭應表現出光譜的公司的活動和非活動的種類，充分分離，以便穩定和熱穩定的光線控制的激活率相比，自發的相互轉換率是非常低的。由于可以photoswitched STORM成像中使用的熒光基團，許多這樣的事實，這些探針還應該表現出高開關可靠性，低疲勞率，和交換動力學，可容易地控制。因此，在光漂白或光控暗狀態而言，最好的探針是那些失活可以平衡，以確保在任何特定時間，只有一小分子中是激活的激活率。
除了高亮度水平和光控穩定性的要求，超分辨率探針必須是能夠擬定精度高的亞細胞目標化，他們應該具有盡可能低的背景噪聲水平。熒光蛋白，混合動力系統相結合的一種基因編碼的目的肽與一個單獨的合成染料膜滲透物的組件，高度特異性的合成熒光團（如MitoTrackers LysoTrackers SYTO熒光團）是能選擇性地靶向蛋白組裝或細胞器。相反，大多數常見的合成染料和量子點首先必須是精確的標記的載體靶向分子共軛。原發性或繼發性的抗體可用于免疫熒光法來合成的熒光基團和量子點定位到特定的亞細胞位置，但接近的熒光探針的目標是由10至15納米的抗體分子介導的，精確的實際熒光涉及的單位又是不確定的。然而，免疫是一個明顯的優勢，它的目標是內源性蛋白，而熒光蛋白融合往往涉及的過度表達可能影響細胞功能的系統。
屬性選擇合成探針STORM成像
| | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| |
表1
表1給出的匯編所選熒光蛋白的性質和合成染料的超分辨率顯微鏡。隨著共同的名稱和/或縮寫詞的每個熒光團的激發峰（實施例）和發射波長（EM），摩爾消光系數（EC），量子產率（QY），相對亮度，和每分子發射的光子數每個開關周期（N個光子）上市。C-羅丹明B和C-熒光素指籠衍生物。指定ND表示尚未確定的值。創建此房產已被科學和商業文獻資源的目的不是要全面。公布的報告，由于在某些情況下，廣泛的光譜的激發和發射上市的高峰值可能會有所不同。以實際的熒光顯微鏡調查，一個特定的熒光基團的實驗亮度可能會有所不同（相對而言），在此表中提供的亮度。在眾多潛在的這些差異的原因，在傳輸或反射率的光學顯微鏡和相機的效率依賴于波長的變化。
最初是使用一對的橙色和紅色發射硫雜羰花青染料Cy3和Cy5，組合以形成被稱為作為花青開關的風暴。實際上，Cy5標記可以熒光燈和暗態之間切換在一個控制和可逆的方式，使用不同波長的光（參見圖5）。用紅色激光燈（633，647，或657納米）激發產生熒光Cy5的PhotoSwitch的染料也可以回到一個穩定的黑暗狀態。暴露在綠色激光燈（約532納米）將轉換Cy5的從黑暗狀態的熒光狀態，但恢復的速度取決于第二激活染料，CY3接近。CY3-Cy5的菁開關疲勞率是優秀的，因為Cy5 的永久漂白發生之前，可以開啟和關閉數百次photoswitched。這種染料對標記具有多個分隔的開關由一個明確定義的數目的堿基對的短的雙鏈DNA分子，和風暴用于解決具有高的精確度之間的距離，相鄰的花青開關。
STORM成像，也可用于各種其他光開關的合成探針。在其最簡單的形式中，使用一個單一的熒光染料的光譜線的連續波激光器的工作緊密地重疊的染料的激發光譜時，可以實現風暴。的Alexa Fluor 647因此可以用657納米的激光，完成所有三項任務所需的風暴，包括從探頭的激發熒光成像，，驅動探頭進入一個黑暗的狀態，并重新再次回來熒光狀態。的熒光花費其在熒光狀態，當系統達到平衡的時間大約為0.1至0.3％，使約6,000個光子被檢測每個開關周期。高光子通量和低活化平衡的結合提供了一個顯著的提升圖像分辨率明顯提高，這是比傳統的寬視場熒光圖像。此技術非常適合于成像微管，肌動蛋白絲和中間細胞骨架細絲直徑阿貝衍射極限遠低于。
圖5中所示的光控特性和分子結構的硫雜羰花青STORM成像利用活化劑，報告染料對。光譜上不同的組合，這些熒光團具有光控的行為，如在圖5中所示的（a）所示，在下部面板突出的熒光實時痕跡三個光開關記者：Cy5的（黃線），Cy5.5標記（橙色線），和Cy7（紅色線）。每種染料配對用Cy3標記的單元，作為活化劑染料。在圖5（a）的上面板的痕跡用于激活的報告染料的綠色脈沖激光（532納米）。遠紅外激光（657納米）連續照射試樣激發熒光記者和切換回來到一個黑暗的狀態。合適的分子結構硫雜羰花青記者和活化劑的熒光基團（b）至圖5中顯示的相似性，這些探針。
Alexa Fluor 647（圖5）是光開關硫雜羰花青，呫噸類合成的探頭，可以通過暴露于中等或強激光照明，這取決于實驗參數的熒光和暗狀態之間的可逆循環越來越多的家庭的成員。許多這些探針已用了數十年在制備標本寬視場和共聚焦熒光顯微鏡，應該是同樣有用的超分辨成像。因此，廣泛的熒光團，最初認為是耐光以來被證實進入黑暗狀態，低氧條件下存在脂肪硫醇在溫和的激光功率。其他人可以利用簡單的無機水性的緩沖器或組織文化傳媒具有較高的激光功率成像。表1中所列的幾個研究得最多的合成染料是有用的風暴。這些措施包括ATTO Alexa的熒光染料，染料，carbocyanines，光致變色羅丹明和幾個籠染料。
熒光蛋白也可以用于單分子的超分辨成像，首先利用公知的變化作為光活化定位顯微鏡。這些獨特的基因編碼的熒光探針的內在能力定義的波長帶的光曝光時改變它們的光譜性質，并能夠針對亞細胞結構具有高的特異性水平。熒光蛋白已被報道經過多種新穎的光致光控的特性，包括產生不同的發射和非發射狀態，以及上銷的閃爍行為。然而，這些屬性最有用的是光敏，光電轉換，光控，這是已統稱為光高亮物業。因此，光可活化熒光蛋白能夠從一個黑暗的狀態被激活，一個明亮的熒光紫外或紫光照明時的狀態，而，可以光學熒光photoconvertible蛋白轉化熒光發射帶寬從一個到另一個。其中最有用的超分辨成像的光活化的熒光蛋白的PA-GFP和PA-mCherry1的（參見圖6）。已證明有效的超分辨技術的photoconvertible熒光蛋白包括串聯二聚體Eos的（tdEOS），mEos2，Dronpa，rsCherry（可逆地切換），和青色的光活化的變型中，PS-CFP2。
潛在的最有用的一類光學熒光筆熒光蛋白包括那些能夠光控間明亮的熒光和暗的狀態，如Dronpa和rsCherry的。不幸的是，這些變種已經不是特別有用，在單分子超分辨調查，由于低光子輸出在明亮的狀態。改進的光開關的熒光蛋白變種出現時超分辨成像的候選人，因此，這將是有益的。熒光蛋白的亮度問題，仍然是一個問題，當這些探頭相比，一般具有顯著較高的光子輸出每個分子的合成染料。例如，tdEos的相反，在超過6000的光子通常觀察到的光開關的熒光Cy5標記的每個分子中產生大約500個光子。另外，硫雜羰花青染料，可以進行漂白，而不是使用熒光蛋白的數量非常有限，當之前的數十至數百個開關周期。除了從亮度的問題，新熒光蛋白候選人必須被監控生色團的成熟率和單體的性格與宿主蛋白，以避免緩慢的發展和聚集文物，分別為目標融合時表示。
量子點是無機半導體納米晶體表現出由于密閉激子發光的熒光性質。由于這些熒光基團的金屬性質的，鈍化層和親水性涂料必須應用到量子點作生物應用，和定位的，它們必須是綴合到鏈霉抗生物素蛋白，抗體，或一些其他的生物活性序列。在量子點的有利條件是其顯著對稱的熒光發射的個人主頁上，可以忽略不計的漂白率，一般高的量子產率。此外，這些探頭具有廣泛的吸收分布，使他們能夠在一個不同尋常的寬波長范圍內被激發。不幸的是，卓越的耐光性的量子點，產生了一個問題，為的隨機超分辨成像，直到量子點可以被轉換成一個光開關的狀態的情況下，就不會被解決。此外，針對量子點，這通常顯示高背景水平和窮得多的合成染料標記的同行相比，本地化仍然是一個問題。
一個大型圖書館籠合成染料相似的光可活化熒光蛋白（PA-GFP和PA-mCherry1）作為探針隨機超分辨成像的所有變化，包括風暴將特別有用。然而，在目前的時間，此熒光類別沒有被廣泛開發和市面上唯一的候選人籠熒光素和羅丹明，這已被證明是有效的單分子超分辨實驗版本。保持器型的合成材料可以使用的紫外線照射，以產生表現出優異的對比度，可以定位精度高，則光漂白的熒光物種的保護的酯部分脫離。盡管這些探頭，其他合成染料相似，受到普遍缺乏特異性，需要援助的共軛抗體或其他靶向肽，他們持有高光子探頭風暴的重大承諾。然而，直到出現較大的品種籠熒光團，這個類將仍然是有限的，對于許多應用。
在選擇超分辨成像探針，研究者面臨著使用合成染料或熒光蛋白的決定。利用免疫熒光技術標記細胞內的結構的缺點是，靶向抗體過大，無法滲透膜，因此，唯一有用的靶抗原，除非在固定和透化細胞的質膜的外部區域上顯示。標記抗體的效率也相對較低，并可能增加10至20納米的本土化標簽和目標之間的不確定性。與此相反，熒光蛋白通常駐留于5納米的靶向蛋白。的角度，但是，使用的抗體為目標合成探針風暴和相關技術提供了更高的信號電平比熒光的蛋白質，這是更有益的活細胞成像。應當指出，高濃度的氧清除劑和脂肪族硫醇，常常有必要與流行的合成染料和單激光器產生光控可以與活細胞的不兼容。
超分辨率顯微鏡探針發展的未來努力將集中在增加的特異性和非常明亮的光開關熒光標記效率的同時，降低靶向部分的大小。夫婦合成熒光基因編碼的目標序列設計的混合動力系統，意味著目前的趨勢和成功的那一天，這些探頭可能是能夠實現這個目標。在這些系統中的最高性能的候選人利用一個小的肽是在活細胞中表達，并能夠招募合成的熒光基團，產生有針對性的熒光。其他方面的發展圍繞減少通過尋找更小的基因編碼的獨立的單位，如植物光素的光，氧，和電壓（LOV）域，其中包含大約一半的水母和珊瑚蛋白質的氨基酸的熒光蛋白的大小。然而，無論在建立新的，更美好的熒光基團的進度（或缺乏），超分辨率顯微鏡承諾今后許多年里繼續留在最前沿的光學顯微鏡。
影響因素STORM成像分辨率
STORM，PALM，FPALM的技術，如超分辨單分子成像的理論基礎雖然先前已詳細討論了，在確定任何特別的調查使用這些方法的實際結果的因素有很多。其中的關鍵方面是必須考慮的是，每個單獨的定位測量的準確度，已被定位在最終圖像中（通常被稱為分子密度）的探針的密度，和標簽本身的物理尺寸。分辨率和單分子定位精度之間的關系是很容易確定。能力解決兩個熒光分子作為單獨的實體的位置定位的精度，這決定了（不確定性）的每個分子中，從而對之間的距離是有限的。反過來，定位的精度，主要是依賴于單個激活，去激活周期期間收集的熒光分子的光子數，提供了背景噪聲可以忽略不計。
分子密度和最終圖像的分辨率之間的關系方面的奈奎斯特采樣理論，這需要約兩個數據點的每解析單位是最好的描述。在情況下，標記效率（有效，則該部分被標記的目標）的一個標本是不夠的，如精細結構細節不連續的工件可以出現在超分辨率圖像。因此，對于一個二維圖像，具有大小為α的空間特征，所需的最低必要的，以滿足奈奎斯特準則本地化的熒光探針的分子密度是：
奈奎斯特分子密度≈（2 /α）2 （5）
因此，例如，為了實現20納米的分辨率在兩個方面，一個熒光團被定位，至少每10納米和一個非常高的分子密度為每平方微米約10,000個分子是必需的。20納米級分辨率的三維超分辨，需要大約一百萬的熒光團每立方微米。在實踐中，分子密度低得多的試樣的幾何形狀是考慮到時，通常就足夠了。生物結構通常是異構的，所以，即使與靶標位點的相對高豐度的飽和標記可能會導致一個相對較低的總密度。在一般情況下，熒光探針，必須存在足夠的密度，以充分的標記結構的細節映射。由相同的標準，必須有足夠數量的這些熒光探針在成像過程中成功地定位。
在單分子中的超分辨技術，在時間上分離的熒光發射通過采用光開關的熒光基團（如PALM和風暴），該比率的開和關切換動力學實驗是一個關鍵的參數，應該進行微調的分子密度。在上述情況下為10,000每平方微米的熒光基團的分子密度，為了實現最終的分辨率為20納米的橫向平面，約600個熒光團必須駐留在側向投影的點擴散函數。這種分子密度高，可并發光開關熒光，多數不是在他們的黑暗狀態，導致高背景噪聲的事實。這些熒光發出微弱的熒光，或者他們可以自發地切換到完全沒有激活照明的熒光狀態。可以是自發的或產物可以通過成像激光誘導的非特異性激活。在分子的密度非常高的情況下，可以產生大量的非特異性激活的熒光基團的單分子圖像的重疊，從而損害的能力，以實現高精度的定位。因此，最好采用光開關的熒光基團，表現出低暗態的排放和低的非特異性激活率。
圖7中給出，是一個重要的概念，涉及在單分子的超分辨成像的空間分辨率影響最重要的因素之一。與分子密度的分辨率表示在圖7中為一系列在一個測試模式中的黃色像素。成像功能，可能會對本樣本中的分子密度減小（從底部到頂部的圖7），并在逐漸降低的信號-噪聲比（像素為單位的分數），這些功能變得不可解析，當平均分子分離方法的特征尺寸（在圖7中的最上面一行）。因此，等式（5）中所描述的，為了實現N倍的尺寸D， ND -倍的像素越多，必須獲得較高的分辨率。信號采集速率（每秒檢測到的光子）必須增加的一個因素中的至少ND.這就需要有一個高ND倍，激發激光曝光所需的每個圖像。
在時間分辨率，基于單分子的超分辨的方法不直接產生一個圖像，而是用于映射確定從數千個別成像幀的特定的分子的本地化。在這種情況下，時間分辨率確定由數量的幀所需要的，以獲得合適的圖像的成像。此外，PALM和STORM成像的光開關熒光的性質可以產生顳成像速度的約束。熒光蛋白是極好的情況下，需要到一個特定的細胞器或生物分子組裝的本地化用作基因編碼的探頭。然而不幸的是，熒光蛋白表現出相對緩慢的光控動力學相比，許多合成的探針，如Cy5和的Alexa Fluor 647。后者可以表現出高開關速度，使分辨率為約30納米，這是幾個數量級大于所得到的熒光蛋白的1毫秒成像周期。切換周期的速度，幫助確定單分子超分辨率顯微鏡的時間分辨率將是最終的限制，這種方法適應活細胞成像。
雙色彩風暴成像
在熒光顯微術的主要優點是容量乘以與一個以上的熒光基團標記的圖像樣本來生成圖像的二，三，四種顏色，幫助解開的相對的組織和不同的生物結構或分子之間發生的相互作用。在兩個或兩個以上的熒光標記探針駐留在同一決議體積的情況下，他們可以被視為經典的共定位分析算法，以確定發射光譜之間的重疊程度（因此，體內分子間的相互作用產生有關潛在） 。的能力進行調查，在兩個或兩個以上的顏色是必不可少的，用于探測生物分子之間的相互作用，并提供了寶貴的洞察許多生物過程的性質，如果它可以成功地應用到超分辨率成像。
在熒光多色成像的基礎在于找出一些光學分辨的探針可同時施加到試樣的要求。風暴，原來的硫雜羰花青染料對的方法，當創建一個調色板，每個光開關的探針組成的組成的記者探頭可以進行成像和關閉，以及活化劑的探針，用于激活記者耦合染料對通過吸收特定波長的光，其吸收光譜的重疊。例如，多達九個分辨的探針可形成一個組合配對的三個熒光報告基團（如Cy5標記，Cy5.5標記，和Cy7）具有不同的發射波長和三個活化劑的熒光基團具有不同的吸收光譜（其中包括的Alexa Fluor 405，CY2和Cy3）。利用這一戰略在風暴中的第一個多色成像示威，利用DNA分子固定在表面和雙色免疫熒光標記微管蛋白涂層坑標本成像。STORM成像能夠實現橫向分辨率為約25納米，使用兩個或三個不同激活每個配對的記者一樣。使用一個單一的報告染料的主要優點是，因為本地化沿著相同的光學路徑成像的熒光基團是來自于單獨的通道對齊。
在圖8中，提出了一系列的拍攝的圖像在寬視場熒光（圖8（a）和圖8（b））和兩色的單分子的超分辨（風暴）成像（圖圖8（c））。的檢體是一個固定的制備粘附非洲綠猴腎細胞進行免疫染色用的染料對的Alexa Fluor 405和Cy5標記線粒體，以及以反白顯示的微管網的Alexa Fluor 488和Cy5。在圖像采集，使用405納米和532納米的激光脈沖交替序列依次激活探頭。激活的探針，然后用657納米激光照射的收集圖像。分子本地化pseudocolored根據相應的激活激光（品紅在405納米和綠色為532納米）。在水介質中染色細胞成像重建從約500,000本地化百分點。白盒中的寬視場圖像（圖8的（a）），相應的風暴圖像的比較，與圖8中的（三）在圖8（b）對于已展開。請注意風暴如何清晰圖像解析即使它們密密麻麻的線粒體和微管相比傳統的寬視場熒光圖像，可以更精確地確定其空間關系。
也可以實現彩色超分辨成像相結合，合成染料和熒光蛋白標簽。例如，使用的組合rsFastLime（綠色熒光蛋白光控來自Dronpa的）和硫雜羰花青，Cy5標記，研究人員能夠通過順序光控熒光蛋白記者和合成染料標記的微管進行兩色成像。多色成像單獨使用熒光蛋白已被證明是更困難的，因為預活化的熒光蛋白的活化后的狀態的另一個重疊的狀態（由于非常廣泛的吸收和發射光譜的發射光譜的這些探頭）。第一個示范用熒光蛋白質與photoconvertable熒光蛋白標記，分別在固定的細胞肌動蛋白和粘著復合tdEos耦合綠色光控Dronpa的的兩色成像。兩個熒光基團依次成像，第一成像由Dronpa其次畢竟的tdEos分子光漂白tdEos。不幸的是，需要消耗一個探頭成像前，不允許同時多色成像，從而提出了一種時間分辨多色成像的障礙。此問題被克服由最近開發藍移Dronpa變型中，稱為BS-Dronpa，和紅色的光活化的熒光蛋白，PA-mCherry1的。配對bsDronpa Dronpa，或PA-mCherry1的PA-GFP，使兩色同時成像。然而，仍然需要不斷地開發新的熒光蛋白和合成染料photoswitches的方便快速的多色成像。
三維風暴成像
絕大多數生物結構的三維實體，從而表現出橫向和軸向尺寸范圍在幾十微米或以上的功能，很容易解決的許多流行的成像方式在熒光顯微鏡。這種能力擴展到單分子的超分辨成像，精確地確定一個機制來激活熒光橫向和軸向位置的境界是必要的。不幸的是，熒光團的軸向位置上的準確的信息是很難取得衍射受限的三維成像，因為焦平面附近的區域中的點擴散函數是對稱的。的對稱性，呈現?的確切位置的兩個分子位于焦平面上方或下方的一對夫婦的納米之間難以區分。此外，該點擴散函數也包含在焦平面附近的一個較大的區域（高達幾百納米）使其難以跨越的熒光有關的軸向位置的信息很少本地化分子居住的任何地方附近的寬視場顯微鏡的焦平面。
幾個創新的解決方案已經被提出用于三維超分辨單分子成像，包括在兩個不同的焦平面成像，干涉，傾斜的反射鏡，和卷積的點擴散函數的傅立葉變換的一個更復雜的數學模型（如雙螺旋點擴散函數），使用空間光調制器。然而，最簡單和最直接的技術之一涉及熒光散光存在于作為?深度的函數的單分子發射器的基礎上，確定的軸向位置。最初開發的輔助系統進行三維成像風暴，由弱柱面透鏡成像光學列車定位在儀器配置。在操作中，為每個熒光的圖像的形狀（實際上，橢圓度）成為一個高度敏感的方法，它的焦平面的距離（沿z軸的）的圖像的質心，而用于本地化的橫向（x ?）的位置。
的三維的風暴成像達到接近50納米600納米的z方向的范圍內未經掃描的試樣，而執行掃描制度允許幾微米深度的標本是約25納米的軸向分辨率的同時橫向分辨率成像。圖9所示的（a）是一個三維的風暴系統的簡化框圖的光學列車的原則確定的橢圓率的基礎上，其圖像的熒光探針，通過引入到成像的柱面透鏡的軸向坐標圖路徑。該系列的單分子的光學圖的右側的圖像顯示的熒光在各種?位置。在一個固定的猴腎細胞中的微管網絡從一個三維風暴圖像的 x - Y視圖在圖9（b）在軸向位置的信息編碼，根據圖9（d）圖的彩色欄。在圖9（b）中所示的白盒的放大該x - Y區域在圖9的（c），與相 應的x - ?視圖圖圖9（d）中，以證明可以解決的，單個微管相當很好的軸向尺寸，使用暴風影音技術。
單分子風暴型三維成像的另一種方法利用多焦點的平面成像，以實現軸向分辨率的衍射極限以下。通過同時成像在試樣中的兩個焦平面，激活的熒光團（一過聚焦和underfocused的）的圖像可以被分析，以適應一個三維點擴散函數，以確定它們的空間坐標。光斑尺寸之比的軸向位置的單調函數，因此，可以定量評估。稱為雙平面軸向定位顯微鏡，這種技術是通過約800納米，在z方向的成像能夠不借助軸向掃描技術掃描和幾微米之間。雙平面成像的主要好處之一是，橫向分辨率的圖像的軸向位置無關。作為該方法的測試，證明的軸向尺寸，分辨率為75納米的三維成像的熒光涂層的有孔玻璃珠，直徑4微米。
使用寬視場顯微鏡與空間光調制器，以產生雙螺旋的點擴散函數已被修改時，就可以實現使用單分子成像技術的三維精密定位。該儀器被配置為包括被稱為f的圖像處理部，其目的是產生的雙螺旋的點擴散函數卷積的標準顯微鏡點擴散函數（所產生的單分子發射器）與在檢測路徑空間光調制器。此卷積乘以標準的顯微鏡圖像的傅立葉變換的專門的點擴散函數（這是一個純相位的功能）中的孔共軛平面。為一個單一的發射器所產生的點擴散函數包含兩個主要的裂片，其與發射器的軸向位置旋轉的角度取向。熒光團（焦平面的上方或下方）的軸向位置通過建立的校準曲線，可確定10至20納米的精度（標準偏差），這對應于25至50納米（即完整的軸向分辨率寬度半最大值; FWHM）。最復雜的方面的雙螺旋顯微鏡的結構的液晶空間光調制器，這需要一些相匹配的輔助消色差透鏡。
至目前為止，最高分辨率的示范單分子進行三維成像定位顯微鏡結合使用的干涉。稱為iPALM，該方法能夠實現約10納米的垂直和橫向尺寸20納米的分辨率。純設計的中心上的應用程序的干涉測量的差異在兩個位置依賴途徑所采取的單光子發射的試樣后，分光鏡復合，從而使光子本身可以干擾。其中最關鍵的環節iPALM連貫性，儀表校準和容忍的波動性熒光的特殊要求，滿足條件使用一個專門的多相分光鏡。此外，成像深度（Z）被限制到約200納米。iPALM已被用來解決的軸向尺寸的膜，粘著斑，微管，內質網。不幸的是，任何商業為iPALM實現儀器的復雜性隨著嚴格的校準程序可能交的限制了它的廣泛應用。
活細胞STORM成像
能力進行時間分辨的圖像序列捕獲的活細胞和組織的熒光顯微鏡的標志成果之一，并可以實施與幾乎所有的對比度或光學切片模式，包括寬視場，激光掃描共聚焦，旋轉盤，總的內部反射和多光子顯微鏡。超分辨率顯微鏡將這種能力擴展到納米級的分辨率無疑將提供令人興奮的新的見解，許多發生在活細胞的基本流程和交互。即使單分子和聚焦的光點擴散工程超分辨率顯微鏡方法仍處于起步階段，一些突破性的發展已經發生，顯示未來時間的調查，使用這些方法的承諾。因此，示范視頻率STED活神經元與60納米的橫向分辨率成像代表什么樣的未來可能的一個極好的例子。
雖然單分子定位的超分辨技術已普遍認為需要太多時間在圖像采集方面有多大的價值在活細胞成像，一些調查已經成功地證明了這種方法收集的時間數據。作為一個例子，細胞膜的微觀結構監測通過跟蹤光活化的GFP（PA-綠色熒光蛋白）融合的血凝素分子具有40納米精度的運動。此外，在活細胞中的單粒子跟蹤與納米空間精度已被證明在一些場合，盡管這些研究是有限的跟蹤只有一個或幾個分子的同時，并沒有用于創建超分辨率圖。然而，使用光學熒光筆熒光蛋白可以在同一單元中進行跟蹤，以獲得高分辨率的信息從粒子徑跡上的相關的蜂窩結構中的一個和兩個色實驗大量的蛋白質分子的運動。
粘著斑復合物在活細胞中，用熒光蛋白tdEos photoconvertable超分辨率成像與單分子定位精度進行了演示。獲得每25秒和60秒之間的圖像幀速率（遠遠慢于許多傳統的熒光成像方式是可能的），設有一個約60納米的橫向分辨率的數字視頻可視化粘著斑逆行運輸和伸長率，并允許不同的形態觀察。如圖10所示的單分子定位的圖片，粘著蛋白的樁蛋白活的中國倉鼠卵巢細胞中表達的融合到tdEos。白色，黃色，和青色的箭頭突出顯示個別粘附配合物所觀察到的圖像捕獲的時間過程（1105秒）的相互作用和伸長率。單分子超分辨成像顯示中不可見的廣角熒光，并透露自己的真實尺寸大得多的內部細節出現同質化的功能，在廣角新生粘連。
活細胞成像中也得到了證實使用直接的的風暴（dSTORM）的，它依賴于一種自然發生的含硫醇劑（還原型谷胱甘肽）的存在下，在動物細胞中減少的狀態，在毫摩爾濃度是本。，因為dSTORM利用常用的有機熒光基團（如Cy5標記的Alexa Fluor 488，ATTO 655）所表現出的的固有光控性能，是不要求精確的共軛的第二熒光激活。因此，dSTORM可以產生衍射極限的下方，使用與選定的合成熒光標記活細胞顯著提高了分辨率的圖像。該技術也被檢查翻譯用Cy5的Alexa Fluor 647標記的微絲在體外吸附在玻璃表面，應該很容易轉換成應用程序與其他常見的生物大分子沿肌球蛋白II網絡。其中，使用dSTORM在活細胞中的限制因素是在與合成的熒光基團標記的細胞內的目標的難度。然而，開發新的細胞透性的染料耦合混合貼標技術的進步，應該在未來的努力，進行活細胞成像實驗使用dSTORM富有成效。
結論
迄今報告的風暴和相關技術令人印象深刻的決議并不代表單分子定位顯微鏡的極限。使用這些方法的空間分辨率的精度和密度的分子本地化，（提供儀器完全調整），殘留的黑暗狀態的熒光，熒光亮度從黑暗中的熒光自發活化率主要取決于決定狀態下，標記效率，標簽的大小。在有足夠的探測亮度和分子密度的情況下，預期的分辨率幾乎可以是任意高。例如，一個明亮的熒光探針如的Alexa Fluor 647預計將產生足夠多的光子，使一個只有幾納米的定位精度，從而看好真實的分子級分辨率。但是，在這一級，探針的物理尺寸成為一個關鍵因素，所以，在理想情況下，將熒光團直接結合的生物分子還。幸運的是，一些新近開發的方法，使特定的附件小的有機熒光細胞的蛋白質通過基因編碼方法，并提供了一個的標簽策略可能支持分子級分辨率。
STORM成像，將有一個直接關系到成功的活細胞觀察的另一個重要方面是數據采集速度。由于本征時間和空間分辨率之間的折衷，超分辨率成像一般是比較緩慢的。更具體地，構造風暴圖像繪制在許多成像幀的檢體中的寬視場視圖累計本地化。因此，成像速度在風暴需要準備一個高分辨率的圖像的幀的數量是有限的。相比之下，聚焦的光點擴散函數的工程技術，如STED，有限的時候需要掃描整個標本的一個小的焦點。因此，單分子技術有望比STED相關的方法要快，成像時，一個大的標本地區，但慢的時候成像面積小。目前，風暴的最高分辨率圖像采集時間通常需要幾分鐘。然而，在60至70納米的空間分辨率，時間分辨的圖像的時間分辨率在活細胞中的幾十秒鐘的聚集。應該預期將改善與成像速度更快的相機，較高的激發功率，探頭具有更快的光控率。