尼康顯微鏡：多色共聚焦顯微鏡的光學像差和物鏡選擇

優化的設計簡化了激光共聚焦顯微鏡的程度上，它已經成為一個標準的細胞生物學研究工具。然而，激光共聚焦顯微鏡變得更加強大，他們也變得更加苛刻的光學元件的。事實上，導致圖像質量的細微瑕疵廣角鏡的光學像差可以產生毀滅性的影響，在激光共聚焦顯微鏡。不幸的是，通常是隱藏的嚴格的光學要求，激光共聚焦顯微鏡的光學系統，保證了一個清晰的圖像，即使在顯微鏡是表現不佳。光學制造商提供了廣泛的顯微鏡物鏡，分別為特定應用設計的。本報告演示了如何權衡參與物鏡設計可以影響共聚焦顯微鏡。

在過去的十年里，共聚焦顯微鏡已開發的技術僅限于專家在顯微鏡成標準的研究工具。它的增殖應用盡可能多的從激光共聚焦顯微鏡技術的快速發展，從成熟的商業共聚焦顯微鏡系統的用戶界面。最新的系統是近交鑰匙系統，即使是新手顯微鏡能迅速收集高質量的圖像。具有諷刺意味的是，同樣的技術發展也刺激了共聚焦顯微鏡實驗生物學中蔓延推理解共聚焦顯微鏡的光學性能比以往任何時候都更重要的方式，使光學共聚焦顯微鏡的極限。

共聚焦顯微鏡的最常見的應用是比較分派或多個探頭在同一個細胞的行為。這樣的研究已經成為可能，能夠有效地收集多種顏色的熒光，并開發新染料，延長有用的光譜，熒光顯微鏡，共聚焦顯微鏡的發展。根據顯微鏡的配置的不同，可能需要這樣的研究，使用的光的波長范圍從紫外到紅外的光學元件。要求準確的彩色成像中得到了進一步的發展比色法定量顯微鏡，如熒光比率測量離子濃度增加。

避免色差的光學設計的方程，這也考慮單色像差和參數，如光子效率高，視野大小，視野平直度，工作距離，和深入含水生物組織的圖像的能力只是其中的一部分。由于光學顯微鏡的設計體現了妥協這些不同的參數，制造商通常會設計出各種不同的顯微鏡物鏡，與各代表一組特定的設計權衡和各適合特定的應用程序。這里討論的研究表明，顯微鏡物鏡的選擇可以產生深遠的影響，激光共聚焦顯微鏡實驗結果。他們強調顯微鏡仔細選擇的物鏡是適當的實驗應用的重要性。

一個理想的鏡頭將所有顏色的光集中到同一個點。在現實中，所有的鏡頭有色差，不同顏色的光都集中到不同的點物業。通過顯微鏡目鏡觀察樣品時，這種缺陷使物體看起來有顏色的邊緣。當成像彩色共焦顯微鏡中的樣品，這種缺陷在顏色不同的激勵照明被聚焦到樣品中的不同點，并收集從樣品中的不同點的不同顏色的發射。在圖像平面的水平方向發生位移，稱為橫向色差，因此在不同的放大倍率不同的顏色。此問題可以被最小化，通過限制分析顯微鏡視場的中心。然而，垂直色位移沿焦軸，簡稱為軸向色差，整個顯微鏡視場。這顯然是一個問題，任何研究人員嘗試使用彩色激光共聚焦顯微鏡確定的相對分布多個探頭。3示出了圖1中的圖像，通過彩色共焦成像的結果如何關鍵取決于顯微鏡物鏡的性質。

數字提供了比較平場氟40倍的物鏡，這是專為最高紫外線光傳輸性能，與100x物鏡，平場復消色差透鏡設計最大程度減少色差。比較的一個方面，從玻璃蓋玻片面的反射圖像的垂直系列收集，可以使用488或647納米的光。由于是由一個單一的表面反射不同顏色的光，無色差的透鏡聚焦不同的顏色相同的焦平面。當重放的作為垂直的橫截面，一個理想的透鏡收集的圖像將顯示單個水平行中，這兩種顏色完全重疊。在圖1的上半部分（一）說明XZ截面的玻璃反射，與震源（z）的軸垂直方向，并展示該平場復消色差透鏡100x物鏡接近這個理想的工作做一個可信的，解決的圖像兩種顏色的光在彼此的0.1微米的深度內。相比之下，微創矯正40X平場氟物鏡檢測647納米的光，約1.2微米以上的488納米光的反射。玻璃反射的圖像，647納米光顯示為紅色，和488納米的光，以藍色顯示。比例尺表示的距離為1微米。

垂直差異的影響，這是明顯的熒光。此面板的下半部分（圖1（a））示出了垂直的橫截面有三個熒光團標記的有孔玻璃珠的圖像卷。使用100倍的俯視復消色差透鏡物鏡成像時，三個顏色重合，從而在一個白，合理圓形的圖像。與此相反，40倍物鏡產生一個明顯的垂直位移的紅色（600納米）或綠色（520納米）的熒光圖像，其中的遠紅光熒光（680納米的排放量，以藍色表示）。此外，輕微的水平位移的遠紅光的熒光反映橫向色差。

本發明提供一種生物的試驗片，優勢的事實，即胞內體孵育細胞與熒光標記的內吞作用的配體可以被標記。在每個核內體中的大量的分子，可確保每個將包含相同的比率熒光探針。因此，內涵體生物樣品中的顏色，將每個熒光反映相對熒光的貢獻，因為他們目前次解析度對象提供了一個極好的彩色激光共聚焦成像測試。圖1（b）示出了彩色圖像的細胞，核內體中，已標記的兩個fluoresceintransferrin（F-Tf的，發出綠色熒光）和Cy5-轉鐵蛋白（Cy5的-Tf的遠紅熒光），使用100倍的收集平場復消色差透鏡物鏡。兩個探頭的共定位個人在不斷的橙黃色的顏色是明顯的內涵體和更加明顯的F-Tf的（圖1（c））和Cy5-Tf的高倍率圖像的比較（圖1 （d）條）。在這些圖像中（圖1（b）至圖1（d）段），比例尺表示的長度為10微米。

然而，當切換到40倍的平場氟物鏡時，在焦平面上的細微的差別是顯而易見的，即使之間的紅色和綠色的熒光標記的TF結合的熒光素和若丹明（圖圖2（a））的細胞中，如圖。焦平面之間的紅色和綠色的熒光令人吃驚的差異導致的F-Tf的和Cy5-Tf的，現在似乎是完全不同的（圖2（b））的表觀分布的差異。

對于誰是評估各種探頭的相對分布的細胞生物學家，這些位移會帶來災難性的后果。焦平面上的差異，可以規避和總結整個垂直一系列的圖像卷成一個單一的投影，這消除這兩種顏色的焦平面上（圖2（c））的效果差異。在投影演示的每一個內體顏色一致的黃色在每個內體的兩個探頭的恒定比例。然而，由于此過程中丟棄所有垂直的信息，這是很少以適當的方式呈現共聚焦圖像。軸向色差的影響，也可以最小化，通過測量不同顏色的軸向偏移，并適合于每種顏色的焦平面從收集到的圖像相結合。此過程的一個例子，圖2（d）中所示，其中顯示了綠色和遠紅光合并圖像采集間隔1.2微米與40倍的平場氟物鏡。在圖2的圖像的比例尺表示10微米的長度。實現通過組合從不同的焦平面的圖像的校正是明顯的，當比較各個探測器的圖像，如圖3所示。而圖3（a）和圖3（b）表示在采集圖像的在相同的焦平面，比較圖3（b）和圖3的F-Tf和Cy5的-Tf的分布之間的一致性差，（c）表示遠紅光的圖像可以被收集1.2微米更深的綠色熒光圖像疊加。（圖3（a）至圖3（c）），在這些圖像中的比例尺對應的長度為5微米。

雖然在不同顏色的光被聚焦在圖像體積的不同點色差的結果，球面象差可以深刻地降低共聚焦顯微鏡中的信號。球差透鏡軸向和周邊的光線集中到不同的點，從而造成圖像模糊的點光源。在共焦針孔相同的方式，有效地提高圖像的對比度通過拒絕焦點外的光，它有效地消除了大部分的熒光成像的球面像差的對象。

對于許多樣品，球面像差的主要來源，源于浸沒介質和安裝介質的折射率之間的差異。直到最近，最高分辨率，最佳矯正顯微鏡物鏡被設計為使用以石油為浸液。對于這些物鏡，球面像差被最小化時，整個光路有浸油的折射率（這是與玻璃相同），并隨距離累積到具有不同折射率的介質。由于大多數樣品 - 特別是生物樣品 - 被安裝在明顯低于浸油的折射率的介質，因此，球面像差限制使用油浸物鏡的圖象的卷的深度。

圖4顯示了在共聚焦顯微鏡，100倍的油浸平場復消色差透鏡的物鏡是用來收集與F-Tf的標記的細胞的圖像和安裝，數值為0微米的深度處（在蓋玻片的表面）中的球面像差的影響（圖4（a）條）（35微米）到水性介質中（圖4（b）條）。在這兩種情況下，核內體出現急劇定義，但累計深刻地影響到水性介質中的光路35微米的球面像差，在圖4（b）的熒光信號。比例尺表示在圖4中的每一個的圖像的長度為10微米。

近日，光學制造商已經解決了這個問題通過用水作為物鏡浸泡介質的物鏡設計。對于水樣品，浸泡和采樣介質的折射率匹配使得球面像差的成像深度無關。這使得這些物鏡，深受工作距離許可證，動輒數百微米到樣品收集到的圖像。這種設計的成功是圖4所示的（（c）和（d）項），顯示圖像與F-Tf的標記的細胞，收集為零（圖4（c）），或66微米到水性介質中（圖4（D）），用開水浸泡60倍平場復消色差透鏡物鏡。在此，水溶液樣品介質的光的路徑，通過熒光信號的影響。這種新一代的高數值孔徑，平場復消色差透鏡水浸泡物鏡顯著幫助共聚焦顯微鏡在三維生物成像實現其潛力。

這種水浸泡的物鏡的色彩表現介于油浸平場氟和前面討論過的平場復消色差透鏡物鏡。的玻璃表面的反射，在圖5（a）可看出，647納米的光被聚焦約488納米的光的0.6微米以上的上半部分的橫截面的圖像。卷收集了類似的模式為0或63微米到含水介質中表明，這種差異是獨立的成像深度。

左下的圖像，在圖5中的（a）示出的遠紅光的圖像的這種顏色的差異導致的三重標記的珠被移位的紅色或綠色的熒光圖像。在熒光珠的圖像中，520納米的排放量都顯示為綠色，600納米紅色，680納米（遠紅光）的排放量在藍色的排放。在此面板中的右下部演示蓋玻片厚度校正球面像差最小化，在這種物鏡的極端重要性。由于球面像差的校正取決于通過蓋玻片的光路的長度，它是根據蓋玻片的厚度被設置領子調節。當左方的橫截面的胎圈收集的衣領設置為測得的蓋玻片厚度（174微米），在右側的圖像采集與衣領錯誤調整到150微米。結果從不當彩色設置嚴重衰減的熒光信號，并損害垂直分辨率的球面像差。雖然這種失調選擇戲劇化一點，我們強調的是，這樣的錯誤很容易，因為在實踐中遇到的實際厚度蓋玻片可以圍繞其標稱值相差超過40微米。正確的衣領設置只能確保通過測量單個蓋玻片。在圖5（a）中的所有圖像，焦距軸是垂直方向，比例尺表示的距離為1微米。

在圖5中（b）和圖5（c）所示的圖像是一個字段的兩個F-Tf和Cy5標記 - 蛋白標記的細胞，并收集到水性緩沖液中為63微米的深度處。圖中標尺為10微米，在這兩個圖像。雖然圖像出現尖銳的，這一物鏡的軸向色差的F-Tf的和Cy5-Tf的分布出現離散的（圖5（b））的效果。盡管如此，這些細胞的圖像的垂直一系列的投影（圖圖5（c）），表明兩個探針同樣標注全部內涵體。在與圖5中所示的反射圖像（一），軸向色差也同樣明顯的圖像中的內涵體零微米的深度處（在蓋玻片表面）收集。差別不大的在焦平面上的紅色和綠色熒光圖像中的內涵體標記的TF結合到熒光素和若丹明（圖6（一）），但F-Tf的和Cy5-Tf的觀察再次出現標簽內涵體的離散人口（圖6（b）條）。

兩個探頭的分布，可以得到更好的允許時，焦平面的差異，并用熒光素圖像收集深0.6微米結合Cy5的-Tf的圖像進行比較。現在很明顯的內涵體示于圖6（c）在恒定的黃色兩個探頭的共定位。采集圖像（圖6（d）和圖6（五））在一個單一的焦平面中所示的兩個探針的分布明顯的差異消失Cy5的-Tf的圖像進行比較時收集的F-Tf的圖像，深0.6微米（圖6（f）條）。圖中標尺為10微米的長度在圖6（a）至圖6（c）中，對應圖6（2）通過圖6（六）中的5微米。

色像差的影響，也可以通過測量圖像中的內涵體標記與多個探針的熒光比量化。比直方圖的半對數圖在圖7（a）與FR-TF標記細胞，采集的圖像使用100X平場復消色差透鏡（紅色曲線），40X平場氟（藍色曲線），和60倍的平場復消色差透鏡水浸物鏡（綠色曲線）。圖7（b）顯示與F-Tf的和Cy5-Tf的標記，使用相同的三個物鏡的細胞的比率直方圖。圖7（a）可以看出，若丹明熒光素的比例（紅色到綠色）的排放量是合理的恒定的所有三個物鏡。與此相反，圖7（b）示出100倍的俯視復消色差透鏡，雖然仍顯示變化最小的Cy5的熒光素的比例（遠紅色到綠色），60倍的水浸泡俯視復消色差透鏡能顯示出更多的變化，和40倍氟顯示的平場甚至更多。60x平場的復消色差透鏡和40x平場氟色差的影響更加明顯，當為一個單一的焦平面的分布進行比較，以突起的垂直圖像序列的每一個物鏡（圖7（c）和圖7中所測量（四），分別）。在每一種情況下，在所投影的圖像的熒光比分布窄報告幾乎是恒定的比例，在核內體中的兩個探頭在任何單一的焦平面的圖像，這是不正確的。

研究提出了色差和球面像差如何生動地展示危及聚焦成像性能。在同一時間，他們強調物鏡的選擇，在共聚焦顯微鏡的極端重要性。差的顏色校正將導致錯誤的解釋的相對分布的多個探頭，激光共聚焦顯微鏡的主要應用之一。比量化還演示了如何的色差妥協顯微鏡定量。球面像差造成的不匹配的浸泡和樣品介質惡化垂直分辨率和完全可以抹殺熒光檢測。雖然尤為明顯，激光共聚焦顯微鏡中的高對比度的圖像，這些錯誤也損害常規落射熒光和透照技術所收集的圖像。

主要特點一直紫外線熒光色差。其他研究結果表明重大軸向色差遠紅為好，越來越多地使用顯微鏡的發展新遠紅熒光探針和激光能夠激動人心的范圍。盡管這些研究提出涉及表征點源容易地顯示，這些樣品的問題，這將是更廣泛的探頭清單（但不一定有明顯）。這樣的探針包括胞漿中經常使用的熒光比率測量離子濃度的染料。

例如，由488納米的光激發熒光SNARF-1胞漿pH指示劑，pH值的測量是從熒光的比值在580納米到640納米。對于薄的細胞的細胞內pH值的測量，這是容易想象有可能會受到的單元格的位置，相對于單獨的焦平面綠色的激發光，紅光和遠紅光發射熒光的比率。雖然這些錯誤經常會簡單地增加測量（兩倍或三倍提出的量化標準偏差）的變化，他們也可以系統性影響比測量，例如，當比較不同厚度的不同部位的細胞的比例。

色差的最終后果，雖然不是這里討論的，是如何影響熒光檢測。在共聚焦系統的色差，激發和發射波長激發一個卷不同的卷的成像結果之間的差異，熒光信號的衰減。對于束掃描系統（大部分共聚焦顯微鏡）離軸距離與信號惡化，這方面的損失共焦針孔成像點聚焦越走越遠。

必須強調的是，這些觀察結果不是唯一的，以用于在所給出的數據，或特定制造商的具體物鏡。刻畫的彩色校正相同再現60倍水浸泡的物鏡，并在三個例子，兩個例子既的Quantum和DIAPHOT顯微鏡看臺上100倍油浸物鏡。從每一個主要制造商的物鏡已確定在顯著的軸向色差。事實上，無處不在的色差地址色差通過實行特殊輔助矯正鏡片，或完全避免折射和反映物鏡轉向替代顯微鏡設計的發展。盡管如此，光學顯微鏡可能繼續發展，并初步經驗，CFI60光學系統新一代的尼康公司表示，軸向色差校正大為改善。

從表面上看，它可能會出現一些物鏡僅僅是比別人更好。然而，如前面所討論的，物鏡的設計代表了一種妥協的設計參數。因此，每一個物鏡的反映出一組不同的設計妥協，根據物鏡應用。盡管如此，它是可能的，研究人員將需要比目前可在光學設計，迫使它們來設計的實驗，不進行拉伸的物鏡設計的限制。

如果油浸物鏡必須使用在水性介質中的圖像的樣品 - 例如，在活細胞的研究 - 球面像差可以通過最大限度地減少通過在水性介質中的光路，或通過使用油狀的折射率，可以最小化適合的球面像差引起的光路水溶液。

色差問題，可以盡量減少在幾個方面。如果一個特定的實驗中需要使用一個物鏡的具有顯著的色差，最明顯的解決方案是簡單地避免了使用遠紅熒光的染料如Cy5的共。在本次審查討論的結果證明所有的測試物鏡之間的綠色和紅色熒光令人滿意的協議。在一般情況下，最好是使用染料與某個特定的物鏡已得到糾正附近的特定波長的最大激發和發射。第二個解決方案，如上所述，是，收集每個熒光圖像在垂直焦平面系列，并結合不同顏色的圖像，根據焦平面兩者之間的差異。這是一個簡單的解決方案，但不會是適當的快速圖像采集時，是必要的，因為與活細胞。此處未示出的分析也表明，這種解決方案不具有足夠的精度，以用于校正圖像比定量。（或更少普及）甲更昂貴的解決辦法是使用雙光子顯微鏡，本質上是由色像差的影響，只要沒有檢測針孔用于。然而，它的多色能力只有現在正在探索。