尼康顯微鏡：CCD成像基本原理

顯微攝影的主要媒介，在過去的50年里，一直是電影，曾在科學界以及無數忠實地再現圖像從光學顯微鏡。它只有在過去十年中，在電子相機和電腦技術的改進已經使數字成像更便宜和更容易使用，比傳統攝影。

在圖1所示的是一個尼康Eclipse 600傳輸/反射光顯微鏡配備售后市場的珀耳帖冷卻的數碼相機能夠在一個較長的累積期間整合圖像。的照相機系統的控制由一個單獨的單元，其容納在一個IBM兼容個人計算機的FireWire端口的接口。整合期間和其他圖像采集參數選擇由專用的基于Windows的軟件程序。

當相機具有電荷耦合器件（CCD）成像傳感器集成在傳感器上或非常接近的模擬至數字（A / D）轉換器，它一般被稱為作為數碼相機。由于CCD芯片，像所有的光學傳感器，模擬設備產生的電壓不同的流，數字一詞僅用于當那些在計算機兼容格式在相機和輸出電壓進行數字化處理。在一個12位的數碼相機中，從CCD的模擬信號被數字化，由板上的A / D轉換器具有12位深度。與否的輸出實際上可以被分解為4096個離散的強度水平（12位）取決于相機上的噪聲。為了區分個人之間的強度等級，每個灰度級的步驟應該是大于約2.7倍的相機噪聲。否則，步驟2982和2983之間的差異，例如，不能得到解決的任何程度的確定性。一些所謂的12位相機有這么多的相機噪音不能受到歧視，4096個離散的步驟。

如果開始的是模擬信號，數字化過程中的相機，而不是下游某處為什么？使用相機的A / D轉換器有兩個好處：減少噪音和計算機兼容直接輸出。一般情況下，越接近A / D轉換是到傳感器時，噪聲電平越低。從CCD的低層次的模擬信號噪聲比他們高層次的數字更為容易損壞。在理想情況下，在A / D是CCD芯片上，緊鄰的傳感器的輸出放大器。噪聲越低，更多的灰度級可以被識別，因此，可以被有效用于強度測量的位數越多。

數碼相機的模擬對應的幾個優點。數碼相機產生不同于攝像機的隔行掃描信號生成逐行掃描輸出。需要專門的隔行掃描視頻信號的數字化采集板和幀緩沖區。逐行掃描攝像機的輸出可以直接連接到計算機（例如，IEEE-1394，RS-422或SCSI接口）。在逐行掃描相機，整個圖像的曝光時間（也表示為整合期）期間首次收購，然后讀出，線線從頂部底部的圖像。現代高速放大器和A / D轉換器，允許數碼相機全幀圖像的速度等于或超過視頻幀速率。

數碼相機的另一個優點是，輸出完全適合在計算機顯示器的格式。由于信號已經數字化，圖像存儲，處理和顯示，大大簡化了類似的演習相比，使用視頻信號。數碼攝影照片，幻燈片和底片的處理中被淘汰的困難，因為現在許多科學期刊接受的數字圖像文件。其結果是提高質量公布的圖像中顯示的演示。數字化圖像處理，壓縮，通過網絡傳播，粘貼到文檔中，或調整成一張海報。

CCD架構

兩個CCD數碼相機設計中常用的隔行傳輸和幀傳輸。的行間傳輸CCD采用電荷轉移通道，每個光電二極管的旁邊，使得所累積的電荷可以是有效地和快速地交給他們的移位器（圖2）。隔行傳輸傳感器也可以被電子關門傾倒所存儲的電荷，而不是轉移到傳輸信道由“關”。幀轉移CCD采用由兩部分組成的傳感器，其中的上半部分是由一個不透光的掩膜覆蓋，并用作存儲區域。光被允許落在露天部分，所積累的電荷，然后迅速移入標記的存儲區域。而信號的受光部的傳感器被集成時，所存儲的電荷被讀出。

科學應用的波長選擇過濾器或傳感器的攝像頭單CCD攝像頭，用于兩種類型的數碼相機的色彩。兩者都使用過濾器來產生紅色，綠色和藍色的版本的字段的視圖。單傳感器攝像機使用一個濾光輪或液晶可調諧濾波器，獲得紅色，綠色和藍色的圖像順序的。三個傳感器的相機有一個分光棱鏡和修剪過濾器，使每個傳感器圖像適當的顏色，并同時獲得所有三個圖像。不變的是，彩色攝像機的比單色因為加分束和波長選擇元件較不敏感。在某些應用中，特別是免疫能力或快速連續同時捕捉多個波長的靈敏度的損失所抵消。此外，一些彩色攝像機達到一個更高的分辨率，通過對角抵消了紅色，綠色和藍色的傳感器，每個傳感器的像素的三分之一，從而增加兩倍獲得的樣本的數目。

雖然CCD攝像機的制造商和用戶經常是指每個光電二極管的像素（圖像元素），就沒有必要的傳感器和在計算機監視器或打印機中的像素的數量和位置之間的對應關系。然而，顯示器或打印機的分辨率應至少高達傳感器。

量子效率

量子效率（QE）是指，被檢測到的入射光子數的百分比。（為便于參考，我們的明視覺的QE是3％左右;圖3）。硅光電二極管，CCD的基本構造塊的，具有較高的量子效率（80％）在廣泛的范圍的可見光譜和近紅外到，如在圖3中示出。的CCD的分光靈敏度低于一個簡單的硅光電二極管，因為CCD電荷轉移通道在其表面上，可以降低峰值量子效率為約40％。

最近，一些科學級CCD的渠道的透明度已增加，量化寬松政策在藍綠色的范圍提高到近70％。從表面通道的損失完全消除在背照式CCD。在本設計中，光落到后面的CCD的區域中，已經通過蝕刻減薄，直到它是透明的。可實現高達90％的量子效率。然而，早變薄的結果是，至今為止，只采用科學級，慢掃描CCD相機在一個微妙的，相對昂貴的傳感器。

在CCD相機的噪聲

有兩個主要的噪聲源在CCD相機的暗噪聲和讀出噪聲。雖然已取得了很大的改進在過去的幾年里，在室溫下在減少CCD暗噪聲，冷卻芯片進一步降低了噪音每20℃下降了十倍。黑暗的噪音是最明顯的，因為“熱”在積分周期為4或5秒后，與室溫CCD相機獲得的圖像的像素（白點）。冷卻至0℃，通常是足夠的積分周期長達30秒。需要很長的風險（例如，化學發光法）的實驗需要傳感器的溫度更低。數碼相機提供在非制冷或制冷版本。

噪聲源不同，數碼相機，以及幾種常見的類型為示波器圖4中的痕跡。光子噪聲，暗電流，固定模式噪聲，和光響應不均勻性所產生的CCD的本身，而復位噪聲，I / f噪聲和量化噪聲的數字輸出的模擬信號的放大和轉換過程中發生。CCD芯片上，每個光電二極管所存儲的電荷（即，像素）轉換成要量化的A / D轉換的模擬電壓的放大器中產生的讀出噪聲。讀出噪聲可以被看作是“收費”，用于讀取所存儲的電荷必須支付。如果此收費已穩步下降5-10電子/像素由于在CCD設計的改進，在過去的幾年中，時鐘和抽樣方法的大小。讀出噪聲讀出速度成比例地增加。去的成本，更快的更多的噪聲，因此，更多的不確定性中的電壓確定較低分辨率的位數號碼。這就是為什么慢掃描攝像機通常具有較低的讀出噪聲比更快的輸出檢測器，并具有較高的有用比特數。數字came4ras范圍從8-12位深度為30幀每秒輸出16位深度在1-2幀每秒。

要的速度/讀出噪聲問題的解決方案之一是在一個大的CCD使用多個輸出放大器（抽頭）。而不是讀取所存儲的電荷，從整個CCD通過一個輸出放大器，該傳感器被分為4個或8個部分，每個都具有其自己的放大器。圖像讀出部分，然后縫合在一起，在軟件中的每秒數幀的速率。每個放大器所需的速度和相關的噪音也相應降低。

信號噪聲比

由于光子隨機到達傳感器表面，它們的數量波動與泊松統計檢測到的光子數的平方根等于所描述的噪聲。當然，相機噪音將這個光子的統計噪聲，進一步降低S / N。最高的S / N，可以通過一臺數碼相機的最大累積電荷（全井容量）的平方根。一個簡單的估計點的任何圖像的同質區域的S / N是該地區的平均強度除以該地區的強度的標準偏差的利息。

多少像素的數碼相機已經足夠？

的分辨率的CCD光電二極管和它們的大小相對于投影的圖像的數量的函數。現在已是司空見慣的數碼相機CCD 1000×1000的光電二極管陣列。消費者和科學級CCD制造的趨勢是減少，傳感器尺寸為4 x 4微米小一些CCD光電二極管。從采樣理論，只能達到足夠的分辨率的一個對象，如果至少有兩個樣本為每一個解析的單元。（許多用戶喜歡三個樣品每解析單位，以確保有足夠的采樣）。

最大分辨率像素的大小要求
在光學顯微鏡

表1

在落射熒光顯微鏡，阿貝1.4的數值孔徑鏡頭在550納米的衍射極限是0.22微米。100倍的物鏡，受衍射限制的點上的CCD面對投影大小為22微米。只是讓一個光電二極管尺寸為11×11微米的光學和電子的分辨率要匹配，一個7×7微米光電二極管的首選。在光學顯微鏡的最大分辨率像素大小的要求列在表1中的4倍到100倍的物鏡放大倍率范圍。100倍的物鏡并沒有額外的放大倍率7×7微米的光電二極管，1000×1000 CCD捕獲70×70微米的物體平面的一個字段的視圖。當適當的采樣適當地調整大小的圖像投射到CCCD，更大數量的CCD中的光電二極管，而不是增加該字段的視圖的分辨率。各種輸出設備的分辨率的要求，可能需要在傳感器的過采樣，使最終的產品（例如，幻燈片，打印或海報）有足夠的分辨率的最終尺寸。

動態范圍

intrascene動態范圍表示的強度的有用的范圍內，可同時檢測到相同的字段的視圖。interscene的是動態范圍的強度的范圍內時，可以容納不同的視場的檢測器增益，積分時間，鏡頭的光圈或其他變量作相應調整。雖然小的CCD傳感器上從分辨率的角度來看是可取的，它們限制了動態范圍內的設備。的CCD的全阱容量是約1000倍，每個光電二極管的橫截面面積。因此，7 X7微米像素的CCD全阱容量49000電子或空穴。（甲孔的區域的硅從該電子來構成和檢測到的光子的同樣有效的，可以使用的措施。使用的術語電子，雖然大多數的CCD讀出產生的空穴而不是電子的數量。）由于CCD的不具有固有的增益，一個電子 - 空穴對的每個檢測到的光子的累積。

通常被定義為全井容量除以由相機噪聲的CCD的動態范圍。黑暗中，讀出噪聲的總和的平方和的平方根計算的相機噪聲。因此，一個49000電子全井產能的CCD讀出噪聲和暗噪聲可以忽略不計的10個電子的動態范圍大約是4900，對應于12位。但是，數字化，如果這樣的相機的輸出在12位深度意味著，49000電子分為4096 A / D轉換單元，每個包含12個電子（四千○九十六分之四萬九）。由于噪聲是10個電子，每個灰度級的步驟僅是1.2倍的噪音和不能夠被辨別。在10位的數字化會導致在每個A / D單元49的電子，約5倍的噪聲電平，并在1024個灰度級中的每一個然后可以判別。一個制表位深度的灰度層次和動態范圍（分貝）表2所示，它涵蓋了一系列有五個量級。

控制速度，有效像素尺寸和實地查看

慢掃描的數碼相機允許的控制所讀出的速率，在像素的有效大小，構成一個傳感器和該字段的視圖。科學級CCD相機通常提供兩個或兩個以上的讀出率，所以，速度可抵銷噪音交易。一個像素的有效尺寸，在許多慢掃描數碼相機可以增加分箱，一種方法，其中從集群中的相鄰光電二極管的電荷匯集和處理，如果是來自一個更大的探測器。

電荷耦合器件的動態范圍

表2

分級是有用的，當光線水平非常低，幾個光子的檢測，因為它使研究者交易空間分辨率靈敏度。此外，最慢掃描CCD相機允許的感興趣區域讀出選定的圖像部分中，可以顯示和所積累的電荷的其余部分被丟棄。的劃分率一般增加成比例地減少領域的視圖。例如，有傳感器的CCD大小為1000×1000 10幀/ s，可以產生100幀/秒，如果所讀出的區域被減少到100×100二極管的輸出速率。通過交易過場的視圖和幀速率，研究者可以調整到一個更廣泛的范圍內試驗的情況下，將有可能比具有固定的幀速率攝像機。

強化數碼相機

現在，一些制造商提供數碼相機配備了非常低的微光成像圖像增強。這些具有接近的光電陰極，微通道板電子倍增器和磷光發光性的輸出畫面（參見圖5中的插圖）。在這些設備的最新一代的光電面具有較高的量子效率（高達50％），在藍綠色端的頻譜。放大器的增益是在很寬的范圍內具有典型的最大為約80000的調節。從光電面以及從微通道板作為電子倍增噪聲降低熱噪聲的S / N在一個增強型CCD相機下面是一個緩慢的掃描CCD。強化CCD的分辨率取決于增壓器和CCD的，但通常是有限的增強微通道板幾何至75％左右，單獨的CCD。

愈演愈烈的數碼相機有一個的降低動態（和intrascene動態）范圍比較慢掃描相機，而且大多數是有限的10位分辨率。放大器增益可以快速和可重復地改變，以適應場景亮度的變化，從而增加在interscene動態范圍。

事實上，由于圖像增強可門，也就是說，關閉或在幾納秒，相對明亮的物體，可以可視化的“開”的時間減少。門控，強化數碼相機最需要的時間分辨熒光顯微鏡的應用，因為探測器調制高頻增益必須在光源同步。由于活細胞所需的低光照通量，增強型CCD相機經常研究動態事件和比率成像。

選擇適當的相機

沒有任何單一的檢測，在熒光顯微鏡將滿足所有要求，所以的研究者必須妥協。曝光時間往往是最重要的參數。當時間是形象整合，慢掃描CCD相機的表現將優于強化相機在各個領域，在很大程度上是因為其更高的量子效率和更低的噪音。冷卻總是提高數碼相機的性能，但差異可能并不明顯，當積分時間為幾秒或更少的數字化深度為8-12位。對于涉及數字反卷積的應用中，檢測器的選擇是水冷，科學級，慢掃描的攝像頭，能夠產生一個高分辨率的，14-16-位的圖像。光電二極管的尺寸事項;一些CCD具有這么小的像素，可能不得不被限制，以避免飽和的電荷存儲阱，結果可能會受到影響的動態范圍和峰值的S / N的積分周期。如果被調查事件是快速的，但可以精確地觸發，然后緩慢掃描CCD工作在突發模式或高速模式可能是合適的。然而，當該事件是不容易預測，試樣必須在低入射光通量連續監測，增強型CCD檢測器給出。出于這個原因，單分子熒光成像使用加強的數碼相機。

的顯微照片，圖6給出了三重染色與一些熒光發色團的薄邊的小鼠小腸是一個組合epi-fluorescence/phase的對比度的圖像。一個尼康的Eclipse E600，類似于一個如圖1所示，利用與尼康DXM 1200數碼相機記錄的圖像，如圖6。當彩色圖像所需的常規的組織學標本三個CCD攝像機是優選的一個不可分割的顏色掩模廉價的單傳感器的攝像頭。高分辨率，單傳感器CCD攝像頭，配備了一個可拆卸的，紅，綠，藍，液晶濾波器已被證明是非常有用的明場和熒光顯微鏡。

前景

最近的CMOS（互補金屬氧化物半導體）攝像頭預示著一個潛在的未來的重要作用，這些設備在熒光顯微鏡的性能改善。CMOS攝像頭在一個集成芯片上的格式的每個光電二極管與一個放大器和數字化。其結果是成本低，結構緊湊，通用的檢測器的優點相結合的硅檢測沒有問題的電荷轉移。CMOS傳感器允許再次操縱單個光電二極管，感興趣區域的讀出，高速采樣，電子快門和曝光格式的計算機界面。直到最近，他們遭受高的固定模式噪聲相關的開關和采樣文物，但現在正在迅速解決這些問題。它是可能的，他們將替換為在不久的將來的科學應用在數碼相機的CCD。