奧林巴斯顯微鏡：全內反射熒光顯微鏡的介紹
全內反射顯微鏡（TIRFM）是單分子熒光觀察用光學方法。有些生物物理學家已經使用該技術多年，有的則是剛剛開始探索這種多功能的機制研究現象在接口的界限。
今天，技術日益普及與細胞生物學家和神經科學家用它來觀察細胞膜熒光，部分是因為已經開發了新的膜專用染料。在過去，全內反射熒光顯微鏡難以執行由于顯微鏡設置的復雜性，以及達到可接受的圖像的亮度的問題。本應用筆記討論了最近開發的高數值孔徑顯微鏡物鏡，提高的TIRFM使得普及。
背景
全內反射的一種光學現象，可以采用觀察的邊界處發生的事件。當光照射兩個光的不同折射率的介質之間的界面，在大于臨界角的角度入射的光進行全反射。
角以外的全反射，電磁場的輸入/反射光仍然到的z方向延伸。在此字段中的強度，通常被稱為漸逝波，呈指數下降，它的影響延伸到所述第二介質（具有較低的折射率）只有幾百納米。內試樣的漸逝場中的那部分可以被激發，發出熒光，因此可以看出或記錄。這是本質的TIRFM（見圖1）。
全反射的條件由下面的公式給出：
θ(c) = sin-1(n(2)/n(1)) where n(1) > n(2)
其中，n（1）的物鏡的折射率，n（2）試樣的折射率，θ（c）的臨界角。這種情況是相同的，創建的倏逝波。
TIRFM的主要優點是漸逝波的穿透深度淺。只有非常接近試樣表面的熒光分子受激發，創造一個非常薄的光學部分。漸逝場之外，熒光是最小的。（見圖2）效應導致非常高的對比度，具有良好的信號噪聲比的圖像。
TIRFM儀器的光路
科學家已經開發出一些TIRFM技術的設置，其中以下類型常見的有：（1）與照明側棱鏡，以及（2）通過透鏡照明（參見圖3）。
1.設置棱鏡。這種設置是很容易做到的，因為它需要顯微鏡，棱鏡，激光，所有的組件都是現成的。此安裝方法的缺點是，試樣之間的棱鏡和顯微鏡物鏡定位的要求。
2.安裝程序通過物鏡的照明。此安裝程序需要通過顯微鏡，激光被引入，并極大地受益于物鏡的數值孔徑（NA）> 1.4。試樣必須位于玻璃蓋的底表面上。制劑，面向遠離物鏡，訪問，允許使用其他的儀器，如顯微操作器，微分干涉對比（DIC）的照明光學系統，甚至掃描探針顯微鏡。
TIRFM物鏡
奧林巴斯APO 100x/NA 1.65復消色差物鏡（Olympus America Inc., Melville, NY）的數值孔徑大大超過以前最高的數值孔徑的物鏡，即Plan APO 100x/NA 1.4（奧林巴斯美國公司）。活細胞通常具有的折射率在1.33和1.38之間。要實現全內反射，這樣的樣品必須被照射具有數值孔徑大于1.38（表1）。條件的上述和下述列出的方程表達的：
數值孔徑(NA) = n ? sin(θ)
其中，NA是物鏡的數值孔徑，n是折射率，θ是二分之一的物鏡孔徑角。
TIR角度和最大角度為物鏡
| N（1） | N（2） | 全反射角度A（1） | 最大角度（2） |
NA 1.4 | 浸油 | 細胞 | 65.63° | 67.53° |
NA 1.65 | 浸入式液體 | 細胞 | 50.83° | 67.97° |
表1
激發光，必須通過通過鏡頭的大于1.38的數值孔徑錐部。使用一個高性能的平場復消色差1.4數值孔徑的物鏡，一個非常小的部分鏡頭數值孔徑（1.4 - 1.38 = 0.02）可以利用。雖然這是可能的，這是非常具有挑戰性的照明激光對準。即使完美對齊，增加光的強度是困難的，因為微乎其微的數值孔徑保證金。很明顯，類似的APO 100x/1.65透鏡有更大的數值孔徑緯度（1.65 - 1.38 = 0.27），使其更容易引入的激發光通過物鏡出射光瞳（圖4和表1）。
為了維持的數值孔徑，并實現了圖像質量的物鏡的能力，高折射率（浸沒液體[Cargille實驗室，雪松樹叢，NJ]：n（d）= 1.78），必須使用一種特殊的液浸介質。（這是揮發性的，并應處理使用好實驗室工業實踐）。
此外，玻璃蓋必須具有較高的折射率（n（d）= 1.788;奧林巴斯美國公司），但是其制造的非常低的音量使得它比較昂貴的。
其他應用程序
該鏡頭具有其他應用程序的好處。良好的近紅外傳輸，使得它非常有用激光捕獲（傳輸1064納米等于60％）。超分辨率DIC提供一個專門的棱鏡，利用在物鏡的數值孔徑。
熒光顯微鏡獲得了超過30％的強度的的數值孔徑100x/1.4客觀優勢。全內反射熒光顯微鏡，DIC，和標準的熒光顯微鏡的技術也可以結合。
組態
TIRFM作者的設置（表2和表3中給出的細節）使用IX70倒置顯微鏡（奧林巴斯美國公司），配備包括右側的的相機端口和IX激光端口。激光位于左側的顯微鏡。通過180毫米的的港口激光管透鏡的激光投影到出射光瞳的照明/成像透鏡（參見圖5）。
作為光源，20毫瓦的低噪聲固態激光器，發射532納米（激光，內華達州里諾市的Crysta），被使用。氬氣，氦氣，氖氣，氪激光器也可以被使用，無論是直接地或通過光纖耦合。
用全反射熒光顯微術實現的有限的圖像強度，表明冷卻的黑白相機，如OLY-110，OLYMPIX 2000或MagnaFire（奧林巴斯美國公司）的使用。
樣品安裝IX70 TIRFM
（從奧林巴斯美國公司的產品）
類型 | 描述 | 數量 |
IX701F | IX701F：倒置顯微鏡支架 | 1 |
IX-PR100R | 右側的相機端口適配器 | 1 |
5-UR480 | I7-DIP/RFAC：激光端口B | 1 |
5-UR481 | 激光管透鏡端口B | 1 |
2-U1002 | WH10x：目鏡 | 1 |
2-U100H2上 | WH10xH-2：目鏡 | 1 |
5-UL210 | IX-ILL 100LB：照明支柱 | 1 |
8-**06 | 鹵素燈12 V/100 W | 1 |
6-U210 | IX-LWUCD：長工作距離（WD）聚光鏡 | 1 |
U-P230 | IX-LWPO：偏振片 | 1 |
U-CD436 | IX-DPO100：DIC棱鏡APO100X/NA1.65 | 1 |
U-P100 | U-辭典：DIC棱鏡 | 1 |
U-P235 | IX-AN：分析儀 | 1 |
5-UE400 | IX-RFA / S：熒光照明 | 1 |
9-U723 | 32ND25：25％透射濾光器為佛羅里達州 | 1 |
5-UL593 | IX-UCLHG：佛羅里達州的集光透鏡 | 1 |
5-UL500 | U-ULH：燈箱佛羅里達州 | 1 |
5-UL515 | U-ULS100HG：燈座佛羅里達州 | 1 |
5-LB256 | BH2-RFL-T3：汞燈電源 | 1 |
8-B192 | HBO103：100瓦汞燈 | 1 |
3-U145 | U-B190CT：雙目對中觀察筒 | 1 |
4-U220 | IX-SVL：左側把手載物臺 | 1 |
U-V411 | U-CMT：C型安裝轉接器 | 1 |
U-V420 | IX-TVAD：適配器 | 1 |
1-UB823 | UPLAPO10x/NA 0.4，WD 3.1毫米 | 1 |
1-UB935 | PLAPO100x/NA 1.4，WD 0.1毫米 | 1 |
1-UB615 | APO100x/NA 1.65，WD 0.1毫米 | 1 |
UYCP-11 | 電力電纜 | 1 |
9-U990 | 玻璃蓋5件套APO100x/NA 1.65 | 1 |
表2
推薦的第三方硬件/材料
類型 | 描述 | 數量 |
168MX1780 | 浸入式液體：n（d）= 1.78，0.25盎司 | 1 |
GCL-025-L | 激光532-nm 25-mW | 1 |
07BSF013 | 阻尼穩定桿兩個鏡像 | 1 |
H61386 | 變焦擴束10-20X | 1 |
表3
成像實驗
玻璃蓋，由0.2μm的熒光珠和四甲基若丹明異硫氰酸酯（TRITC）彩色面頰細胞的標本制備的熒光圖像和全內反射熒光顯微鏡圖像進行比較（參見圖6和7）。
在熒光模式下，集中在有孔玻璃珠，珠熒光是很難區分，因為從臉頰細胞的背景熒光遮蔽。在全內反射熒光顯微鏡成像模式下，圖像的對比度顯著高的，有孔玻璃珠可以很容易地觀察到。
只有在近場（下面試樣側蓋玻片表面幾百納米）被激發。面頰細胞的倏逝波的到達，不利于熒光圖像。在其他實驗中，觀察DiI染色的Hela細胞和神經元，熒光和全內反射熒光顯微鏡進行了比較。在每一種情況下，全內反射熒光顯微鏡允許非常高的對比度觀察細胞表面（圖8和9）。
結論
APO 100x/1.65是一個非常高的分辨率物鏡是提供TIRFM利息增加的時候。的物鏡，方便的IX70配置，相對經濟的固態激光器的高數值孔徑帶來TIRFM技術顯微成像技術成為主流。的客觀與TIRFM中的應用提供新的和令人興奮的調查研究界的機會。