徠卡顯微鏡：熒光定量

眼見為實-測量知道。這個方程反映在14 個世紀科學的發展，從自然哲學到現代科學同樣適用于熒光成像和生物科學技術。顯微鏡生成圖像不僅用于說明，但也量化。更先進的技術使用照明模式（無圖像形成）或不會產生形象可言-但仍然是顯微技術。這些F-技術正變得越來越重要，在當前生物科學。

的擾動和松弛：FRAP和FPA

一個非常著名的化學和物理的方法是放松方法。測量的信號-在我們的例子中的熒光強度-平衡常數。-作為一個脈沖或跳的參數發生擾動后，強度將改變，并達到新的平衡。動力學的變化反映了該機制的細 節，排除競爭的途徑。該計劃提供了一個優雅的方式來測量熒光標記分子的流動性。如果該字段的一小部分是通過施加強烈的光線（脈沖擾動）漂白，熒光將減少。情況下，分子是不能移動的，漂白面積將保持黑色。如果熒光分子通過擴散或通過活動進程，可以移動，將再次恢復熒光漂白區域。因此，這個協議被稱為熒光漂白后恢復（FRAP）。擬合模型曲線的松弛部分的信號所揭示的基本機制。和分數的分子是不動的（不動的分數）是來自于均衡信號電平的比值。

圖 1：時間在FRAP實驗過程中的熒光強度。在一個感興趣的區域中，漂白后的熒光的強度恢復到一個新的平衡。恢復噸的1/2的一半時間，容易地提取從回收的動力學。另外，不動的部分漂白脈沖之前和之后的均衡強度的差異是明顯的。

FRAP通常用于測量在細胞中的擴散過程。除了傳統的FRAP，有時會使用衍生工具：瓣，這是熒光漂白后虧損。在這里，漂白連續發生在一個地區，有沒有交集漂白面積。iFRAP表示整場除了一個小區域被漂白的方法。發現更多的縮略詞漂白方法，但這些都沒有實際意義。

技術上相似，但基于一個完全不同的機制，激活熒光蛋白實驗。這些蛋白是熒光的，并可以由不同的照明顏色的接通和關斷。或者，熒光發射光譜的變化后，開關照明。它的優點是，人們可以對一個黑色的或不同顏色的背景中檢測到的熒光，并按照在細胞或組織（熒光蛋白激活FPA）的分子的擴散或主動轉運。

這些方法并不只適用于流動性的測量，但也動力學測量濃度的變化。最為人熟知的，如鈣離子指標。莫代爾生物傳感器，往往基于FRET-FLIM的，允許各種各樣的細胞以被監視的參數，其中包括代謝物的濃度和膜電位。

福斯特的相互作用：FRET

圖 2：如果發生福斯特共振能量轉移的供體與受體的激發光譜，兩個分子重疊的發光光譜非常接近（幾埃）。時的距離一半的光子將被轉移由該過程被稱為福斯特半徑（通常為0.2?1納米）。

當從熒光分子發射一個光子，波長為斯托克斯位移紅色，即能量小于激發。如果第二個熒光分子（接受器）的第一個分子的排放物（捐贈者D）的范圍內的激發能的緊密接觸，能量被轉移的概率增加的距離的6 個功率不發射和吸收（無輻射）。這種現象進行了分析，并首先正確描述西奧多·福斯特，因此被稱為福斯特共振能量轉移（FRET）。

一個直接的應用FRET的受體后，僅捐助照明（敏排放SE）所發出的熒光分析。另外，熒光共振能量轉移效率由漂白的受體和供體熒光測量前，漂白后也被測量。如果發生FRET，捐助將更加明亮閃耀受體漂白后，沒有能量流動的受體，因此所有的能量轉化為供體發射（受體漂白AB）。進行這樣的實驗證明蛋白質相互作用，它們的相對距離。

FRET現象還利用現代生物傳感器。這些是（往往是復雜的）分子，含有的供體和受體。結合后，或感測目標，該分子將經歷構象變化，改變D與A部分的相對位置，并因此改變了熒光共振能量轉移效率。這些傳感器是非常敏感的，由于1 / r的6依賴福斯特的Wechselwirkung的。

熒光壽命（FLIM） - 告訴許多故事

圖 3：影響的FRET熒光壽命。如果福斯特半徑內的供體，受體是不是沒有能量轉移，興奮狀態持續時間較長（無需額外漏）。當受體接近供體，能量轉移到受體從激發態和激發態捐助只持續很短的時間。

分子或原子的電子系統，由一個適當的能源（顏色）的光子激發時，將假定激發態。從這個狀態下，系統會放松下來到基態，散發出熒光光子。顯然，系統必須縈繞在一段時間內處于興奮狀態。這段時間稱為熒光壽命。在一個孤立的分子，平均壽命由量子物理學統治，因此物業的分子。統計分布的實際生存的平均壽命。典型的平均壽命跨度的范圍為0.5?10毫微秒。

在現實中，熒光分子與其他分子的微環境中與輻射相互作用。這些參數可以引起興奮狀態，放松更quickl。一個眾所周知的現象是動態與其它分子相互作用的熒光淬滅。這里，作為熱能量損失。第二個途徑是的福斯特Wechselwirkung，如上所述。如果熒光分子（供體）與受體相互作用，平均熒光壽命降低，由于這一事實，即熒光共振能量轉移過程是一個額外的競爭通路的熒光發射通路。熒光壽命的變化，因此表明FRET發生- FLIM的，這是實際測量的參數與生物傳感器。最后，激動的狀態可能與光子相互作用，從而導致進一步轉換為其他狀態，或通過發射一個額外的光子（刺激啟動返回到基態發射）。

排放下降脈沖激發和隨后的測量是通過測量實際的平均壽命的熒光染料，或通過的調制激發和測量的相位和振幅調制的發射。最準確的和通用的測量時間相關的單光子計數（TCSPC）采用從激發的第一光子發射的時間延遲的測量。其結果是一個分布曲線（通常是一個指數衰減），它允許提取的壽命曲線擬合。此方法被施加到所有像素的圖像，最后產生的熒光壽命圖像（也被稱為“頭圖”）。在這些圖像中的值是不是灰色的強度，但時代。

除了感測環境的優勢，FLIM的獨立的染料濃度和吸收的工件，例如在深層的樣品。

無圖像的顯微鏡：FCS和衍生工具

圖 4：在HeLa細胞中的TiF1a-GFP映射的濃度。APD的圖像進行的校正與FCS點測量。投資回報為FCS測量顯示為黑色十字架。的濃度，計算從自相關曲線（紅色和藍色的曲線圖）。細胞內的濃度是一個空間的地圖。相關曲線測量點產生顆粒蠕動信息。

共聚焦顯微鏡觀察是從一個微小的衍射光斑發出的光。該測量是作為時間的函數的光的強度。通過掃描在樣本點和斬波信號轉換成短條，這些位可以被分配并存儲在一幀存儲區中的像素。如果正確觸發，幀存儲包含作為一個兩維空間的功能（圖像）的強度分布。

另一方面，它也有可能只分析信號及其變化-帶或不當場移動樣品。這種方法允許多種測量。首先，平均強度通常會減少由于漂白現象。此外，三重態動力學測量的不同層次之間的照明開關。最常見的，而不是平均的信號，但該信號的變化（波動）進行了分析。如果是所觀察到的樣品中的許多分子，有關的信號的波動是非常小的，因此無法估量的。這種微小的共聚焦的焦點只包含幾個分子（取決于上的光學參數和染料濃度，當然）具有有益的功能。小分子的數量足以探測到由于擴散（或任何其他傳輸機制），焦點體積變化的發生是由于分子閃爍（分子承擔暗的狀態，并返回到興奮狀態）的數量和改建。

通過相關方法的變化的分析，允許測量的染料濃度（樣品中的局部變化）和傳輸動力學。通過擬合模型系統來測量的相關功能，相關的分子運輸機制的分類是可能的。定性的測量也是可能的 - 例如，在各個隔室的擴散系數。

已經開發了各種衍生方法的分離特定的相關性（FCCS）或改進的結果的可靠性和精確度（FLCS）。

電和光遺傳學

除了上面提到的F-技術，很多其他的定量方法在現代研究。最突出的是，大腦的研究是一個領域的各種測量，使用顯微鏡和熒光。一個經典的測量電信號的熒光強度的變化（例如誘導的Ca 2 +濃度的變化檢測出鈣指示器）的相關性。的電信號通常，在大多數情況下通過膜片鉗技術測量電極。

最先進的光遺傳學的方法，即轉基因修改應用光功能的蛋白質，是進入一個新的世界，需要測量的相關性。

圖 5：強度圖（上圖），電氣數據（底部）在心肌細胞膜片鉗實驗記錄。電流記錄（紫色），觸發脈沖（紅色）和行觸發（綠色）。熒光數據線數據采集的觸發表明是完全同步的。禮貌：雷夫霍夫馬德森，西班牙巴塞羅那，加泰羅尼亞心血管病研究所。