奧林巴斯顯微鏡：霍夫曼調制對比的結構

霍夫曼調制對比系統，旨在提高可見度和對比度染色的和有生命的物質，通過檢測光梯度（或斜坡），并把它們轉換成光強度的變化。羅伯特·霍夫曼博士在1975年發明了這種技術，并采用了幾個配件，已經適應了一些商業顯微鏡。

霍夫曼調制對比度的基本顯微鏡的配置在圖1中示出。一種光振幅空間濾波器，被稱為“ 調制”的霍夫曼，被插入一個消色差透鏡或平場消色差物鏡的后焦平面上（雖然也可以用于更高的修正）。通過本系統的光強度變化的上方和下方的平均的值，它的定義，然后，所述待調制。用于調制對比度的物鏡可以涵蓋整個10倍到100倍的放大倍率范圍。調制器具有圖2中描繪的三個區域：一個小的，暗區的外周附近的后焦平面上，其中只有1％的光（在圖2中標記為“ D ”的區域）發送;一個狹窄的灰區發送15 ％（在圖2中標記為“G”的區域）和剩余的清晰或透明的區域，覆蓋大部分領土在后面的物鏡，即100％的光（在圖2中標記為“B”的區域）發送。相襯顯微鏡中的相位板不同，霍夫曼調制器被設計成不改變相位的任何區域的光線穿過。下觀察時，調節對比度光學系統，透明的對象，基本上是無形的，在普通的明場顯微鏡相梯度決定一個明顯的三維外觀。該調制器不介紹在通過調制器的不同部分的光通過的相位關系的變化，但影響的主要的零階最大值。高階衍射極大值不會受到影響。使用邁克耳遜干涉儀的測量證實了，通過霍夫曼風格的調制器通過的光的相位變化而變化（如果有的話）由小于λ/20的一個因素。

下面的階段，一個聚光鏡與旋轉炮塔利用持有的霍夫曼調制對比度系統的其余組件。炮塔的聚光鏡有一個明場開幕孔徑光闌，光圈進行定期的明場顯微鏡和校準，并建立適當的條件下，科勒照明的顯微鏡。在每個其他炮塔的開口，有一個偏離中心的狹縫部分地覆蓋有一個長方形的小型偏振片。狹縫的大小/偏振器的組合是為每一個物鏡的不同的放大倍率不同，因此需要的轉臺安排。

霍夫曼的設計是這樣的，狹縫位于聚光鏡的前焦平面中，如在圖1和圖3中示出。當光線穿過的離軸的狹縫，這是在其中已經安裝了該調制器的物鏡（也稱為傅里葉平面）的后焦平面成像。包含離軸的狹縫板的聚光鏡的前焦面光學共軛客觀后焦平面中的調制器。圖像強度的一階導數中的切片的光密度成比例，并控制相位梯度的零階衍射圖案。

調制對比度的原理提供用于至少兩個基本調制器，在圖2和圖3中示出的狹縫板配置。本討論的目的，被夸大和附圖的圖2中所示的調制器板的尺寸增大。圖2和圖3（圖2（a）和圖3（a））中的左側上的安排是一個對稱的系統，其中調制器灰色條紋和狹縫被放置在顯微鏡的光學軸（中心）。在這個系統中的分辨率被限制為：

分辨率=λ/ NA

其中NA是數值孔徑的物鏡和λ等于波長的成像光源的平均。暗（1％的透射率）和輕的或透明的（100％的透射率）的區域大小是相同的，而灰色區（15％的透射率）是在一個狹窄的條紋形式的，出射光瞳的直徑是10％的的物鏡。其他結構（圖2（b）和圖3（b））是不對稱的或偏移量，其中該調制器的暗區位于外部的出射光瞳的物鏡。在本系統中的分辨率大大改善和方法：

分辨率=λ/ 2（NA）

NA和λ的值是相同的，如上面所述。分辨率中的偏移量的系統（圖圖3（b）），這是顯而易見的，幾乎是一樣好，在中央系統（圖3（a））的兩倍。的透明（清除）區域中的偏移量的系統中，填充與填充其他的10％的灰色區和暗區的物鏡出射光瞳的直徑幾乎90％的。

下面的聚光鏡，一個圓偏振器被放置在顯微鏡的光出射端口的（注意，這兩個偏振器是低于切片）。該偏振片的旋轉，可以控制的狹縫開口的有效寬度。例如，一個“交叉”的兩個偏振器，在90度到每個其他的查詢結果中的“縮小”的狹縫，以便其圖像范圍內，如在圖3中所示的調制器的灰色區域，。偏振器所控制的狹縫寄存器的部分的調制器上的亮區。由于偏振器是旋轉，對比度可以改變以獲得最佳效果。一個很窄的狹縫產生圖像在對比中等程度的連貫性是非常高的。光學部成像的狹縫時，被調整到其最窄的位置，也進行了優化。當圓偏振器的取向，其振動方向平行于偏振片在狹縫，有效的狹縫寬度是處于最大值。這降低了整體圖像的對比度和連貫性，但能夠產生更好的圖像較厚的物體的折射率存在較大的差異。

早期設計的調制對比度系統沒有利用顯微鏡光端口上的狹縫偏振器或圓偏振器，并且如在圖4中所示為一個對稱的配置依賴于單個大小的狹縫。在該圖中，來自源的光通過一個固定的光圈的狹縫（稱為“狹縫板”中的人物），然后通過檢體含有相梯度。這些梯度偏轉光，根據方向的梯度，進入的明確或暗區的對稱式調制器，其定位在后方的物鏡的焦平面。所得到的圖像顯示了一個簡單的對比度是由樣品中的定位和斜率相梯度決定。

在現代先進調制對比度系統中，調制器和該狹縫顯微鏡的光軸偏離。這種安排允許良好的分辨率和細節中的物鏡和結果的數值孔徑的更充分地利用。中呈現的陰影，偽三維的外觀形狀和細節。這些出現的一側上，在中央部的灰，而較暗的另一側，一個灰色背景亮。該調制器的細節（陡度，坡度，折射率，或厚度在試片細節的變化率）的光相位梯度轉換到目鏡膜片的平面中的不同的圖像區域的強度變化。由此產生的圖像與光學梯度方向敏感性有一個明顯的三維外觀。

對面梯度偏轉的狹縫圖像非常暗的部分的調制器或調制器的明亮部分，如在圖5中示出的結果。在該圖中，假設檢體含有正面和負面的相位（厚度）的梯度和一個平面（非梯度）區域的成像使用調制對比度光學元件。在圖5中所示的負梯度（一）偏轉的調制器，它是衰減至約1％的前一個值的暗區的光進入。同樣，在圖5（c），由正梯度進入調制器的透明區偏轉的光不衰減，和100％，該光被發送到中間圖像平面。任何非梯度的切片的一部分（圖5（b））和背景（環繞）上注冊的灰色部分的調制器，其中約15％的光被發送到中間圖像平面。其結果是，從一個側面的梯度強度的圖像區域是暗的。從相反側的漸變的強度產生一個明亮的圖像區域，和非梯度的區域在圖像上顯示為灰色，一樣的背景。

對灰色的黑暗和明亮區域的對比度（與強度變化）給出了陰影偽浮雕效果。這是典型的調制對比度的成像。偏振片的旋轉改變取得的對比度，在舞臺上的檢體（相對于偏振器和偏移量的狹縫）的取向可能會顯著提高或降低對比度。

由于調制器的影響的狹縫的圖像根據如何切片的詳細信息轉移的圖像的狹縫（和因此在改變光強度的結果），它描述一個振幅濾波器。 霍夫曼和其他人已表明，相梯度在切片類似的空間頻率，分布在整個出射光瞳的客觀。的調制器的光傳輸強度分布將提供各種各樣的對象的令人滿意的圖像，產生相位梯度，包括：所有類型的細胞和組織（兩個活，染色和未染色），和表面細節的晶體的，透明的聚合物，眼鏡及其他類似材料。也是有用的成像在不透明和冶金標本和表面細節的復雜的集成電路和其它電子材料的晶粒邊界的反射光的調節對比度顯微鏡觀察。

有許多優點和局限性調制對比度。的一些優點包括更充分地利用物鏡屈服的細節，以及良好的標本對比度和可見性優異的分辨率的數值孔徑。雖然許多標準的調制對比度物鏡消色差或平場消色差，但也可以使用具有更高程度的校正光學像差，如上面所討論的物鏡。許多主要的顯微鏡制造商現在提供熒光校正等級的調制對比度的物鏡，并可以通過特殊訂單消色差。較舊的物鏡往往可以加裝調制器的調制光學公司，該公司成立由羅伯特·霍夫曼博士，專門建立售后和自定義的系統。

除了使用更高的數值孔徑與調制對比度的優點，但也可以使用這種技術指南“ 光學切片 “。剖分允許顯微鏡技術集中在一個單一的薄膜平面的切片從混亂的圖像所產生的區域的平面的上方或下方，正集中在無干擾。顯微鏡的光軸平行的方向上測量的切片的深度。對焦的圖像建立正確的切片至圖像距離，允許發生的衍射波的干擾，在一個預先確定的平面（圖像平面）定位在一個固定的距離從目鏡。這使得衍射要觀看的對象發生在切片中的不同深度的水平分開，只要有足夠的對比度。可以通過順序后面的每一平面上聚焦光學剖切片的整個深度。在這個系統中，定義為從一個層次到的距離的下一個發生的不同的細節成像景深，以及所控制的物鏡的數值孔徑。更高的數值孔徑物鏡表現出非常淺的景深，并，相反擁有較低的數值孔徑為物鏡。一個客觀的隔離和集中在一個特定的光學部分的綜合能力的光學均勻性的標本下降而減小。

圖像出現陰影或偽三維，提高可見性，因為在任一側上的一個細節的對比度差異。客人沒有光暈圖像中表現出不同，產生的圖像與相襯光學。調制對比度的相位梯度轉換成幅度信息的差異是非常不同的相位關系變化（和光程差），所產生的相襯顯微鏡。使用的的暗灰色地帶，在調制器產生的圖像包含深淺不一的灰色，并沒有彩色。通過生產具有同等的透射率值的彩色區取代灰色區和暗區的調制器，它有可能引入到調制對比度的圖像的顏色。在這種情況下，從相位梯度產生的圖像呈現相似的梯度具有相同的色調的顏色。目前，我們不知道任何商業來源，包含彩色區域的調制濾波器。

消色差或平場消色差調制對比顯微鏡使用最廣泛的物鏡，因為他們可以得到很好的圖像，因為顏色不參與。用綠色濾光器（劃歸偏振片）使用這些物鏡，將進一步改善圖像因為消色差透鏡球面校正綠光。更高的校正，包括熒光及消色差，物鏡也可以被用于調節對比度顯微鏡觀察，但增加的費用往往是不值得的圖像質量的提高，除了在非常高的放大倍數。

調制對比度配件的成本大大低于微分干涉相差（DIC）的設備。雖然這兩種方法都需要轉臺聚光鏡與相匹配的每一個物鏡的組件，DIC-設備齊全的顯微鏡還包含下面的聚光鏡和一個之前被放置在光路中的中間像平面（上面的物鏡）的分析儀，偏振器。存在的交叉極化系統，DIC顯微鏡所必需的，削弱其效力的樣品反應偏振光。

自切片沒有位于兩個偏振器之間的，雙折射對象（巖石薄片，晶體，骨等），可以混淆在DIC的圖像，可以被檢查。另外，切片可以包含不劣化的情況下的圖像，因為極化效應的塑料或玻璃容器中，因為這樣的船只，也都超過這兩個偏振器中，而不是在它們之間。這使得霍夫曼系統更有用的細胞，組織和器官培養在塑料容器中進行檢查和顯微攝影比DIC。

當聚光鏡設置在明視場的位置，也可以被用于安裝一個調制器的物鏡進行常規的明場工作。由于調制器是離軸，劣化少的圖像的結果。物鏡（但不是狹縫板聚光鏡）裝有一個調制器也可以被用于熒光和暗場工作，但這些物鏡時，應避免嘗試DIC的顯微鏡。的調制對比度系統已非常成功地使用用偏光鏡，以提高檢測的兩個光學梯度和切片中的雙折射性。在此應用中，使用非偏振光的狹縫和偏振光配置應該是平行的偏振器（雖然劃線偏振片也將產生良好的結果，但與減少的照明）。調制對比度改性的一個目的，是非常有用的，使用普通的偏振光照明而不在聚光鏡中的狹縫板。

霍夫曼調制對比系統也有幾個缺點和限制。圖片必須謹慎對待，因為不同的觀察者可以“看到”的“山”中的形象為“谷”，反之亦然偽三維圖像，通過目鏡觀察。垂直于狹縫的長度，從而在一定程度的技術人員以取得最佳效果的檢體的取向的要求，該系統是最敏感的梯度。

每個物鏡和聚光鏡開口變形的成本必須被添加到這些配件本身的基本成本。復雜的，高的數值孔徑，多元素的物鏡是困難或太昂貴的修改。在最近幾年中，羅伯特·霍夫曼的公司，調制光學的頤，紐約（的全資附屬斜翅片公司），已修改的物鏡和聚光鏡。光學調制專門修改領先的顯微鏡制造商生產的物鏡。有些物鏡很容易修改，而另一些則很難或不可能修改的調制光學規格。然而，可用于任何物鏡公司的中間管系統，包括一個廣泛的范圍跨越100倍的顯微鏡物鏡的宏觀相機鏡頭之一。也包括在這一類的干或浸泡媒體的形象標本（油，水和甘油），單個和多個波長的物鏡，反射和透射光的物鏡，和物鏡校正無論是無窮大或有限的管長度設計的物鏡。調制光學設計和制造自己的聚光鏡的系統，以滿足廣泛的數值孔徑和工作距離組合。

非吸收切片不會呈現在顏色，與觀察到的包含半透明的彩色濾光片中的灰色區和暗區的地方的使用一個特殊的調制器的異常。呈現出的切片，自然吸收的特定波長或淡染的顏色以及與調制對比度和熒光的組合或與組合的調制信號的對比度和偏振光觀察到的那些。

霍夫曼調制對比度顯微鏡的配置是直線前進，基本步驟概括如下：

霍夫曼調制對比度在透射光

· 顯微鏡的物鏡轉換器，將相關的調制對比度功能的物鏡，并包含適當的縫隙板安裝在炮塔聚光鏡。如果在顯微鏡配備作微分干涉相差（DIC）或偏光顯微鏡，去除所有的偏光板，相位差板，和渥拉斯頓或利用Nomarski棱鏡從光路。

· 在舞臺上放置一個染色標本（最好是一個組織薄片），并使用10倍的物鏡（安裝調制器），在顯微鏡對準適當的科勒照明在我們上解剖顯微鏡的部分，概述。調節對比度狹縫板應該從聚光鏡進行此操作。，如果炮塔聚光鏡有一個明場照明孔徑光闌位置，旋轉炮塔選擇這聚光鏡。

· 查看的調制器的板的后焦平面上的物鏡，使用伯川德透鏡（常見的偏振光顯微鏡），一個相位望遠鏡，或者通過簡單地除去的目鏡和對等的眼睛管。請某些該樣本是從光路中，或者它被移動到一個明確區域的顯微鏡載玻片上除去。

· 選擇的狹縫板，其對應于通過移動到光路中的適當的聚光鏡（從轉盤）10x物鏡。應該有一組調整螺釘或桿，使得聚光鏡內的照明狹縫板的旋轉和平移。

· 將圓偏光顯微鏡的光過濾器，聚光鏡下方的端口。此過濾器旋轉，同時觀察通過伯特蘭透鏡（或相位望遠鏡）的狹縫圖像，并觀察到的旋轉角度影響的光量（亮度），通過偏振器的狹縫部分。

· 翻譯的狹縫，使得開口部缺乏偏振片疊加在灰色區域，如在圖3（b）中所示的調制器板的圖像。含有偏振材料的狹縫的部分應當被成像在清澈的調制器部分的灰色區域正右方。旋轉的圓形的偏振濾光器，并觀察含有偏振材料的狹縫的區域如何出現和消失。當的圓偏振器的振動面垂直方向取向的偏振器的振動面的狹縫，狹縫的大小，如果最小化，并得到最大的對比度。這個動作可以練習使用的互動Java教程：

· 刪除伯特蘭透鏡或相望遠鏡和，更換的眼睛管顯微鏡的目鏡。標本放置在舞臺上的候選人，與10倍的物鏡和重點。

· 重新調整視場光闌調整聚光鏡的位置，以獲得清晰的對焦。打開明場孔徑光闌，直到它外面的視野。

· 現在已經準備好觀察和顯微攝影與調制對比度的圖像。旋轉的檢體和/或圓偏振器的顯微鏡的基礎上，以實現最佳的對比度。這些設置會有所不同標本標本。

· 重復上面的步驟，每次不同的放大倍率選擇用于觀看的切片調制對比度。

再一次，我們發現，操縱光的聚光鏡的前焦面（由裝置的一個偏移量的狹縫）和操縱的光的后焦平面上的物鏡（偏移調制器）可以有一個顯著的效果呈現的圖像時在目鏡。