奧林巴斯顯微鏡：熒光顯微鏡優化和故障排除

熒光顯微鏡的一個重要特點是它能夠探測到熒光的對象，有時隱隱可見，甚至非常明亮與黑暗的背景（通常是黑色）。為了優化此功能，使用的引物在該部分將要討論的原則，圖像的亮度和分辨率必須最大化。

圖像亮度 - 優化的圖像的亮度的最重要的方面之一是，以確保在每個連接到試樣的發色基團的適當的波長，樣品被提供用于激勵具有足夠的光能量。同樣重要的是，選擇適當的擋板濾光鏡，向觀察管或攝像管發射的熒光的量最大化。我們已經組建了一個表列出的熒光激發和發射數據，這將有助于實現這一物鏡。高能量的光源，如汞和氙氣的燃燒器，將提供大量的激發能在非常窄的范圍的近紫外和可見光。當使用這些光源耦合到同時阻擋那些是不希望的，能夠發送所選波長的激發濾光鏡，適當地選擇，然后將滿足用于激發的最佳標準。

擋板濾光鏡，防止不需要的波長進入觀察管的選擇是一個主要問題。激發的總能量是遠遠大于發射的能量，因此，重要的是要選擇一個有效的擋板濾光鏡，將阻止不必要的波長熒光發射，同時允許從樣品通過。為熒光選擇的物鏡必須能夠有效地透射光，在近紫外區域和在整個可見光譜。

在低發射的光水平的圖，在熒光顯微鏡中的作用的物鏡是非常重要的，因為它是收集來自樣本的光的物鏡的功能。物鏡所接受的光的錐角是由數值孔徑（NA）為物鏡來確定，如在圖1中示出。在透射光中的熒光顯微鏡，到達眼睛或其它檢測器的光的強度成正比作為物鏡和聚光鏡的總放大倍數的平方成反比的數值孔徑的平方。

另一方面，在反射光熒光的圖像的強度變化直接作為使用中的數值孔徑的四次冪物鏡，以及數值的總放大倍數的平方成反比：

I = NA4 / Mag2 

這種差異來作為物鏡的最初功能作為一個聚光鏡，用于在樣本上的光聚光，然后作為用于圖像形成的通常的光采集的結果。其意義是顯而易見的：高數值孔徑物鏡會產生高得多的強度比相同的放大倍數較低的數值孔徑的物鏡圖像。例如，其他的事情都是平等的，40倍物鏡的NA為1.0將帶來超過5倍的亮度比40倍物鏡的數值孔徑為0.65的圖像。進一步的含義是，如果可能的話，低倍率的視覺目鏡（如8倍的放大倍率）也將增加圖像的亮度相比，比較常用的10X觀察目鏡。此外，在反射光中的熒光，激發光被濃縮的物鏡（在其作為聚光鏡的功能），僅在被觀察的區域。其結果的激勵光的強度遠高于在透射光中的暗視野熒光，其中被激發的面積不改變作為物鏡被改變。此外，在暗視野，物鏡的數值孔徑必須被減小到低于保存的視場的黑暗的聚光鏡。

除了是一個重要的考慮因素的數值孔徑，這是可取的有最高質量的色差校正的物鏡，因為聚焦在同一平面上的各種顏色，將產生更清晰的圖像。另外，更好的球面校正，更清晰的圖像。因此中，物鏡的選擇是平場復消色差物鏡或平場熒光物鏡。的設計應使這些透鏡元件及其水泥本身不會自動熒光時，低于400納米的波長（光在近紫外）光照射。

在可能的情況下，應采用油浸物鏡，從載玻片和蓋玻片表面反射所造成的光損失減少到最小。現代顯微鏡制造商努力為客戶提供光學元件是完全免費的自體熒光污染物，但是這方面也應考慮自體熒光將減少通過增加背景亮度對比樣品。

圖像分辨率 - 皇家顯微學會（RMS）標準蓋玻片厚度如果0.17毫米。中的統計抽樣，由于在制造過程中的波動的蓋玻片這個號碼（通常0.01毫米0.03毫米）的有一種輕微的變化程度。高數值孔徑“干”的物鏡是最容易受到這些變化，許多人提供校正衣領，讓顯微鏡微調物鏡校正玻璃蓋厚度。這是非常重要的，購買高度精確的蓋玻片，確保物鏡校正衣領優化調整。此外，一些廠商提供專業化的物鏡，包含一個內部的虹膜式光圈與100X復消色差透鏡奧林巴斯物鏡如圖2所示。應盡量減少眩光的這個可變光闌（圖2）進行適當的調整，如果配備的話，在使用的物鏡。

當使用油浸物鏡，吸干鏡頭前用紙巾除去油使用后，確保清潔定期用適當的溶劑（通常約一個月一次就足夠了）。多余的油留在浸泡物鏡可以拿起空氣中的灰塵，并降低圖像質量和分辨率。此外，還要確保浸油，無PCB，有一個非常低的或不存在的電平的自體熒光，被施加到沒有形成氣泡的物鏡蓋玻片界面。

顯微鏡的光路中應仔細調整，以確保所有組件都已正確放置并執行，它們被設計。應正確對準光源的電弧光源為我們的討論中所描述的熒光顯微鏡。

清潔光學元件 - 在熒光顯微鏡（和所有其他形式的顯微鏡）的第一條規則是要保持完全免費的灰塵，污垢，油，溶劑和任何其他污染物的光學元件。顯微鏡時，應保持在低振動無煙房，是盡可能干凈，并具有循環空氣的干擾最小。使用防塵蓋顯微鏡在不使用時，保持在氣密容器內的所有配件。避免使用腐蝕性溶劑來清潔顯微鏡的任何部分，并且只能使用稀釋過的肥皂水清洗非光學表面。物鏡應保持清潔使用下面的提示：

?切勿拖動任何具有高度的壓力，包括鏡頭紙在鏡頭表面，以避免表面上的可能性非常細微的劃痕引入。
?用溶劑設計的光學表面，或在緊急情況下，無水乙醇清潔鏡頭。避免其他溶劑，因為它們可能與光學鍍膜玻璃上反應。
?灰塵在鏡頭表面前壓縮氣體用溶劑清洗，以去除松散顆粒。
?浸泡棉條鏡頭清潔劑或酒精輕輕擦拭它在鏡頭轉動棉簽頭幾次，每次傳球前。用鏡頭紙吸干多余的溶劑，并讓鏡頭徹底晾干。重復此過程。

油浸鏡頭可以用溶劑清洗，如上面所述。切勿使用油與物鏡擬用于干燥，因為清潔干燥的物鏡困難得多一個專為油。

進一步提示和故障排除 - 在理想情況下，所有應做顯微鏡在黑暗的房間，但熒光顯微鏡，這一點尤其重要。人類的眼睛有問題，迅速調整到天黑，這將是很難辨別一個非常暗淡的熒光標本后立即變黑房間。通過阻斷激發光時，不觀看或攝影標本，避免過度漂白的標本。盡量減少自體熒光去除多余的熒光在安裝前徹底清洗試樣。對于其他方面的一般問題的解決和故障排除，請參閱下面的表1。

表 1

顯微攝影的熒光標本，提出了一些獨特的挑戰，是無與倫比的光學顯微鏡。雖然相機系統參數保持不變，必須支付更多的關注，暴露的細節和這些文物互惠故障發生的結果非常長的曝光時間。有許多好書的主題，有興趣的讀者被稱為我們的參考書目和網絡資源的進一步信息部分。