尼康顯微鏡：尼康衍射效率增強系統（DEES）

在尼康的A1si的共聚焦顯微鏡，熒光發射光進入探測器首先通過一個專有的衍射效率增強系統（簡稱DEES），分離為兩個正交的偏振光的波陣面（稱為p和s）進入的非偏振光的發光，使用偏振分光鏡。DEES系統的目的是為了增加光的衍射效率由光柵用于分離成不同波長的熒光發射。離開分束器后，在p-波陣面是旋轉90度（成s偏振光的波），使用棱鏡系統和兩個光束然后由三個可互換的光柵衍射。衍射光柵，可以精確地控制，以確保高度的重現性，波長分辨率為2.5，6，和10納米。

本教程2.5納米的衍射光柵安裝在光柵輪，傳入的非偏振光通過通過DEES極化單元初始化。偏振光衍射光柵的32通道光電倍增管由兩個反射鏡，每個波束上獨立地操作，但收斂的光電檢測器上。直接，DEES配置以上示意圖光譜的增強型黃色熒光蛋白（EYFP）在全分辨率取決于衍射光柵的波長增量由儀器檢測。為了操作教程，使用按鈕選擇一個衍射光柵和觀察EYFP頻譜檢測帶寬的變化。Zoom按鈕穿過分光鏡和偏振旋轉器移動的波前產生的特寫視圖。 

最通用的光譜成像的共聚焦顯微鏡配置，可以極大地提高采集速度收集的lambda棧，利用多通道光電倍增管收集后，用衍射光柵分散的有限波長的熒光發射帶。此次收購戰略已經成功地實施，在尼康C1si和A1共聚焦顯微鏡，每一個都能夠高速只有一個單一的掃描光譜采集。多通道光電倍增管（通常稱為多陽極的光電倍增管），在這些儀器中包含的一個線性陣列個別10納米檢測通道內置到一個單一的單元，從而使要成像的多個發射帶平行，從而嚴重地限制了試樣的光漂白和光毒性。尼康光譜檢測單元設有采樣增量2.5，5（或6），和10納米，可以是單獨的光路調整的頻譜帶寬的lambda部分旋轉到的幾個的衍射光柵。分散的排放，然后通過精確定義的渠道多陽極光電倍增管的32通道，每個通道生成一個單獨的圖像。總的熒光發射帶寬取決于由衍射光柵采樣增量：2.5納米的抽樣產生的80納米的帶寬，5納米光柵產生一個160納米的帶寬，而6納米光柵產生192納米的帶寬和10納米光柵產生一個320納米帶。尼康文書，光譜成像檢測器使用的激光屏蔽機制，消除從激勵源的激光反射光，和衍射光柵可以傾斜，選擇進行了子采樣的任何帶寬。 

其中高性能成像光譜共焦顯微鏡的先進功能尼康獨特的專有衍射效率增強系統（DEES），這是設計，消除兩極分化文物，光柵波長減少損失，并捕捉熒光發射的最大金額。DEES系統操作通過雙偏振分束器的光學元件，以產生雙組分稱為p和s的波陣面取向平行和垂直于入射面，分別通過非偏振的熒光發射。最精通的衍射效率與s偏振光被觀察到，因此被定位在通路的p偏振光的光而產生的s偏振光的偏振旋轉器，光柵系統的效率顯著提高。正如圖1（a）中所示，p偏振光的衍射效率是450至675納米的波長范圍內的90％以上。與此相反，s偏振光的效率是80％，在450納米和幾乎呈線性下降到約45％，在675納米。因此，尼康DEES系統可以顯著提高光的通過，因此，靈敏度，在光譜檢測單元。的頻譜寬度的情況下，必須進行調整，可以進行額外的試樣掃描相鄰探測器通道可以組合（稱為分級），雙，三，或四重檢測頻帶的寬度。

雖然基于狹縫的光譜成像的共焦工具能夠在高分辨率成像的發射光譜，它們的速度相對較慢時相比，裝有與多陽極光電倍增管的顯微鏡。即使是那些工具的功能鏡像狹縫部分的帶寬，以反映第二或第三倍增仍然遭受缺乏成像速度為活細胞成像所需的時間尺度。在許多情況下，超過200納米的狹縫系統測量頻譜可能需要幾分鐘或更長時間，從而阻礙了光譜成像的標本，在整個拍攝期間，經過時間的運動。光譜成像顯微鏡的性能，先進的功能，提高靈敏度校正在基于多陽極顯微鏡（參見圖1（b））。這些工具使用的基礎上可溯源的光源的發射線和亮度調整每個通道的波長精度校正。此外，光纖元件的端部和檢測器的表面都涂有一種特有的防反射劑，以減少信號的損失，并實現高的光傳輸。最后，先進的雙積分信號處理（DISP）技術已被添加到圖像處理電路，以提高電效率，防止信號損失，同時數字化器處理的像素數據和復位。其結果，該信號被監測整個像素的駐留時間，從而顯著改善的信號 - 噪聲比。事實上，這些技術相結合使32通道光譜成像（512×512像素）每秒24幀的速度足夠快，為各種各樣的活細胞成像應用。