奧林巴斯顯微鏡激光掃描共聚焦進行活細胞成像的技巧探討

 近年來隨著生物實驗技術的不斷發展，活細胞顯微成像實驗變得越來越重要。細胞中很多重要生命活動的研究，如細胞的分裂、分化，細胞遷移，蛋白質的運輸等過程，都必需通過用顯微鏡進行活細胞成像才可以觀察并記錄到。對于顯微成像來說，激光掃描共聚焦顯微鏡（以下簡稱confocal）是獲得高分辨率特別是高的z軸分辨率圖像的利器。這與confocal 的設計原理相關，confocal的光路中設置了針孔（pinhole），能夠擋住來自于標本非焦平面的雜散光，因此可以獲得薄的光學切片，極大地提高了z軸的分辨率。隨著confocal的普及，用confocal進行活細胞成像的需求越來越多。但是由于confocal儀器自身的特點，以及活細胞對生長環境的苛刻要求，如何用confocal進行活細胞成像需要很多的技巧，而且對confocal的性能要求也特別高。下面我們就用confocal進行活細胞成像遇到的問題以及技巧進行探討。

一、保證細胞正常的生長環境
在用confocal進行活細胞延時成像時，焦平面的漂移問題一直是困擾廣大科研工作者的問題之一。活細胞延時實驗往往需要在confocal上放置活細胞培養裝置，如圖所示，必需保證細胞處于一個合適的生長環境，能夠進行正常的生長代謝。這個活細胞培養裝置需要溫度保持在37℃，通入5%濃度的CO2氣體，并加水保證濕度達到100%。當成像時間較長時，高倍物鏡也需套上一個加溫裝置，給物鏡加溫。

二、如何克服用confocal進行活細胞延時成像中的焦平面漂移問題。
產生焦平面漂移的主要原因在于利用高倍物鏡成像時，由于需要以水或者油為介質，因此熱量會通過介質從物鏡傳遞到培養皿中，延時成像過程中，顯微鏡金屬機身的熱脹冷縮使焦平面發生漂移。由于高倍物鏡成像的焦深比較短，對于焦平面的漂移容忍度很低，因此在采集圖像過程中，我們會發現熒光圖像越來越弱，越來越不清晰，直至無法采集到任何熒光圖像。

為了克服這個問題，我們往往在利用confocal進行活細胞延時成像時，必需用到焦點零漂移補償系統（Zero Drift Compensator, 簡稱ZDC）。ZDC的工作原理是以一束789nm的遠紅外激光探測培養皿與介質之間的反射面，從而利用offset值糾正焦平面的漂移，使采集到的圖像始終處于在焦狀態。以奧林巴斯新的激光掃描共聚焦顯微鏡FV1200為例，該款產品搭載了*新IX3-ZDC系統，不僅具有可以幫助用戶快速找到標本焦平面的“一鍵式聚焦”的模式，還具有“連續鎖焦”模式，很好的解決了用戶在進行活細胞延時實驗時，因加藥而引起的焦平面漂移問題。保證了需要進行加藥的測鈣實驗或者FRET實驗結果的準確性。

此外，FV1200搭載的IX83顯微鏡機身采用了閉合結構及高剛性設計，極大地提高了系統的穩定性。配合IX3-ZDC極大降低了活細胞延時成像中的Z軸和XY軸方向的漂移問題。

三、如何克服用confocal進行活細胞延時成像中的標本熒光淬滅的問題。

標本熒光的淬滅俗稱標本的漂白，是指標本因受到光照射而出現的熒光信號逐漸變弱甚至檢測不到的現象。在用confocal進行活細胞延時成像時，主要有兩方面的因素，會導致標本熒光淬滅。原因之一是在目鏡下觀察標本時，標本受到汞燈等的照射，可能會出現淬滅。第二個原因，也是*主要的原因在于，用confocal成像時，標本因受到激光的逐點照射掃描，更容易出現淬滅。針對這兩個原因，首先，在制備標本時，應該加入放淬滅劑，防止標本熒光信號較快地淬滅。其次，用目鏡觀察標本時，需要盡可能縮短光照時間，降低激發光強度，注意使用電動shutter等。*后，在進行激光掃描成像時，應該盡量降低激光的光強度。仍以奧林巴斯FV1200為例，FV1200搭載的IX83顯微鏡，采用了大靶面新鍍膜技術的激發塊，對激發和發射光的透過率更高，可以用較弱的激發光，在目鏡下觀察到更亮的熒光信號。更為重要的是，FV1200的掃描振鏡進行了**，采用了**的鍍銀技術，其反射效率高于傳統的鍍鋁振鏡的反射效率。特別是在780nm左右的波段，XY掃描振鏡總的反射效率*大可以提高2倍，這樣就可以盡可能用低的激光的強度來采集較亮的熒光信號。另外，FV1200上面可以配備高靈敏度制冷的磷砷化鎵（GaAsP）檢測器。這種檢測器的優勢是QE值比普通PMT要高，特別適合采集比較弱的熒光信號。QE值是指光信號轉換為電信號的效率，QE值越高，光電轉換效率越高。普通的多堿性PMT檢測器QE值低于30%，而GaAsP檢測器的QE值在450nm-600nm波段均達到45%左右。用同樣的熒光標本進行對比測試，以同樣強度的510nm激光掃描圖像，其余條件不變，我們檢測到的熒光信號的亮度可以提高30倍。GaAsP檢測器具有低于室溫10℃的制冷功能，可以使暗電流降低70%左右，采集到的圖像更加明亮、信噪比更高。

綜上所述，在用confocal進行活細胞延時成像的實驗中，我們要注意使用活細胞培養裝置，保證細胞正常的生長環境。此外，成像中使用ZDC防止焦平面漂移。盡量降低激發光強度避免標本熒光信號淬滅。只有滿足了上述條件，才可能采集到比較好的熒光圖像。